Abstract Interferon gamma (IFN γ ) is a potent antiviral cytokine that can be produced by many innate and adaptive immune cells during infection. Currently, our understanding of which cells produce IFN γ and where they are located at different stages of an infection are limited. We have used reporter mice to investigate in vivo expression of IFN γ in the lung and secondary lymphoid organs during and following influenza A virus (IAV) infection. We observed a triphasic production of IFN γ expression. Unconventional T cells and innate lymphoid cells, particularly NK cells, were the dominant producers of early IFN γ , while CD4 and CD8 T cells were the main producers by day 10 post-infection. Following viral clearance, some memory CD4 and CD8 T cells continued to produce IFN γ in the lungs and draining lymph node. Interestingly, IFN γ production by lymph node Natural Killer (NK), NKT and innate lymphoid 1 cells also continued to be above naïve levels, suggesting memory-like phenotypes for these cells. Analysis of the localisation of IFN γ + memory CD4 and CD8 T cells demonstrated that cytokine+ T cells were located near airways and in the lung parenchyma. Following a second IAV challenge, lung IAV specific CD8 T cells rapidly increased their expression of IFN γ while CD4 T cells in the draining lymph node increased their IFN γ response. Together, these data suggest that IFN γ production fluctuates based on cellular source and location, both of which could impact subsequent immune responses.

A gene encoding OvoA, a key enzyme involved in the biosynthesis of ovothiol, was excised form the genome of Leishmania mexicana promastigotes using CRISPR/cas mediated gene editing. The role of the enzyme in synthesising ovothiol was confirmed since both ovothiol A and ovothiol B were lost from the metabolome of the modified cells. The OvoA knockout line had similar growth kinetics to wild-type progenitor cells and, moreover, most of the changes in metabolism that accompanied the transition of log stage growth to stationary phase were mirrored in the KO line. Significant differences, however, were observed in the ratio of the reduced and oxidised forms of the other major low molecular weight thiols, glutathione and trypanothione, indicative of a role of these other thiols in maintaining reduced ovothiol and demonstrating an interconnected network of low molecular weight thiols in these cells. The OvoA knockout cells remained infective to macrophages where promastigotes transformed to amastigote forms in a manner similar to wild-type. The knockout line was tested for sensitivity to a range of current anti-leishmanial drugs and oxidative and nitrosative stresses. While generally the absence of ovothiol caused little or no change in sensitivity to these stress-inducing agents, enhanced sensitivity to amphotericin B was noted.

Influenza A virus (IAV) infection leads to the formation of mucosal memory CD4 T cells that can protect the host. An in-depth understanding of the signals that shape memory cell development is required for more effective vaccine design. We have examined the formation of memory CD4 T cells in the lung following IAV infection of mice, characterising changes to the lung architecture and immune cell composition. IAV-specific CD4 T cells were found throughout the lung at both primary and memory time points. These cells were found near lung airways and in close contact with a range of immune cells including macrophages, dendritic cells, and B cells. Interactions between lung IAV-specific CD4 T cells and MHCII+ cells during the primary immune response were important in shaping the subsequent memory pool. Treatment with an anti-MHCII blocking antibody increased the proportion of memory CD4 T cells found at lung airways but reduced interferon-gamma expression by IAV-specific immunodominant memory CD4 T cells. The immunodominant CD4 T cells expressed higher levels of PD1 than other IAV-specific CD4 T cells and PD1+ memory CD4 T cells were located further away from MHCII+ cells than their PD1-negative counterparts. This distinction in location was lost in mice treated with anti-MHCII antibody. These data suggest that sustained antigen presentation in the lung impacts on the formation of memory CD4 T cells by regulating their cytokine production and location.

Cytokine production by memory T cells is a key mechanism of T cell mediated protection. However, we have a limited understanding of the survival and secondary responses of memory T cells with cytokine producing capacities. We interrogate antigen-specific CD4 T cells using a mouse influenza A virus infection model. CD4 T cells with the capacity to produce cytokines survive better than non-cytokine+ cells, displaying a low fold contraction and expressing high levels of pro-survival molecules, CD127 and Bcl2. Transcriptomic analysis reveals a heterogenous population of memory CD4 T cells with three clusters of cytokine+ cells. These clusters match flow cytometry data revealing an enhanced survival signature in cells capable of producing multiple cytokines. These multifunctional cells are, however, less likely to proliferate during and following primary and secondary infections. Despite this, multifunctional memory T cells form a substantial fraction of the secondary memory pool, indicating that survival rather than proliferation may dictate which populations survive within the memory pool.

Lung structural cells, including epithelial cells and fibroblasts, form barriers against pathogens and trigger immune responses following infections such as influenza A virus. This response leads to the recruitment of innate and adaptive immune cells required for viral clearance. Some of these recruited cells remain within the lung following infection and contribute to enhanced viral control following subsequent infections. There is growing evidence that structural cells can also display long-term changes following infection or insults. Here we investigate long-term changes to mouse lung epithelial cells, fibroblasts, and endothelial cells following influenza virus infection and find that all three cell types maintain an imprint of the infection, particularly in genes associated with communication with T cells. Lung epithelial cells from IAV-infected mice display functional changes by more rapidly controlling influenza virus than cells from naive animals. This rapid anti-viral response and increased expression of molecules required to communicate with T cells demonstrates sustained and enhanced functions following infection. These data suggest lung structural cells could be effective targets for vaccines to boost durable protective immunity.

Influenza A virus (IAV) infection leads to the formation of mucosal memory CD4 T cells that can protect the host. An in-depth understanding of the signals that shape memory cell development is required for more effective vaccine design. We have examined the formation of memory CD4 T cells in the lung following IAV infection of mice, characterizing changes to the lung landscape and immune cell composition. IAV-specific CD4 T cells were found throughout the lung at both primary and memory time points. These cells were found near lung airways and in close contact with a range of immune cells including macrophages, dendritic cells, and B cells. Interactions between lung IAV-specific CD4 T cells and major histocompatibility complex (MHC)II+ cells during the primary immune response were important in shaping the subsequent memory pool. Treatment with an anti-MHCII blocking antibody increased the proportion of memory CD4 T cells found in lung airways but reduced interferon-γ expression by IAV-specific immunodominant memory CD4 T cells. The immunodominant CD4 T cells expressed higher levels of programmed death ligand 1 (PD1) than other IAV-specific CD4 T cells and PD1+ memory CD4 T cells were located further away from MHCII+ cells than their PD1-low counterparts. This distinction in location was lost in mice treated with anti-MHCII antibodies. These data suggest that sustained antigen presentation in the lung impacts the formation of memory CD4 T cells by regulating their cytokine production and location.

Abstract Cross-species transmission of avian influenza A viruses (IAVs) into humans could represent the first step of a future pandemic 1 . Multiple factors limiting the spillover and adaptation of avian IAVs in humans have been identified, but they are not sufficient to explain which virus lineages are more likely to cross the species barrier 1,2 . Here, we identified human BTN3A3 3 (butyrophilin subfamily 3 member A3) as a potent inhibitor of avian but not human IAVs. We determined that BTN3A3 is constitutively expressed in human airways and its antiviral activity evolved in primates. We show that BTN3A3 restriction acts at the early stages of virus replication by inhibiting avian IAV vRNA transcription. We identified residue 313 in the viral nucleoprotein (NP) as the genetic determinant of BTN3A3 sensitivity (313F, or rarely 313L in avian viruses) or evasion (313Y or 313V in human viruses). However, several serotypes of avian IAVs that spilled over into humans in recent decades evade BTN3A3 restriction. In these cases, BTN3A3 evasion is due to substitutions (N, H or Q) in NP residue 52 that is adjacent to residue 313 in the NP structure 4 . Importantly, we identified more than 150 avian IAV lineages with a BTN3A3-resistant genotype. In conclusion, sensitivity or resistance to BTN3A3 is another factor to consider in the risk assessment of the zoonotic potential of avian influenza viruses.