Abstract Mucosal-associated invariant T (MAIT) cells are abundant in humans and recognize bacterial ligands. Here, we demonstrate that MAIT cells are also activated during human viral infections in vivo . MAIT cells activation was observed during infection with dengue virus, hepatitis C virus and influenza virus. This activation—driving cytokine release and Granzyme B upregulation—is TCR-independent but dependent on IL-18 in synergy with IL-12, IL-15 and/or interferon-α/β. IL-18 levels and MAIT cell activation correlate with disease severity in acute dengue infection. Furthermore, HCV treatment with interferon-α leads to specific MAIT cell activation in vivo in parallel with an enhanced therapeutic response. Moreover, TCR-independent activation of MAIT cells leads to a reduction of HCV replication in vitro mediated by IFN-γ. Together these data demonstrate MAIT cells are activated following viral infections, and suggest a potential role in both host defence and immunopathology.

Abstract Influenza viruses can interact during coinfections, allowing viral fitness to be altered by genome complementation and competition, and increasing population diversity through reassortment. However, opportunities for these interactions are limited, as coinfection is blocked shortly after primary infection by a process known as superinfection exclusion (SIE). We asked whether SIE, which occurs at the level of individual cells, could limit within-host interactions between populations of influenza viruses as they spread across regions of cells. We first created a simplified model of within-host spread by infecting monolayers of cells with two isogenic influenza A viruses, each encoding a different fluorophore, and measuring the proportion of coinfected cells. In this system SIE begins within 2-4 hours of primary infection, with the kinetics of onset defined by the dose of primary virus. We then asked how SIE controls opportunities for coinfection as viruses spread across a monolayer of cells. We observed that viruses spreading from a single coinfected focus continued to coinfect cells as they spread, as all new infections were of cells that had not yet established SIE. In contrast, viruses spreading towards each other from separately infected foci could only establish minimal regions of coinfection before SIE blocked further coinfection. This patterning was recapitulated in the lungs of infected mice and is likely to apply to other viruses that exhibit SIE. It suggests that the kinetics of SIE onset separate a spreading infection into discrete regions, within which interactions between virus populations can occur freely, and between which they are blocked. Importance Viral fitness and diversity are altered by genome interactions, which occur when multiple viruses coinfect a cell. This has been extensively studied for influenza A viruses (IAV), which use genome reassortment to adapt to new hosts and create pandemic strains, and whose replication can be compromised by the acquisition of defective-interfering RNAs. Coinfection of an individual cell by IAV is restricted by the gradual onset of superinfection exclusion (SIE). Replication of IAVs within host organisms involve the asynchronous replication of viruses as they spread to infect multiple cells. We found that under these circumstances, SIE creates spatially separated sub-populations of IAV, between which there are limited opportunities for genome interactions. Our work suggests SIE will cause many viruses to segregate into distinct subpopulations within their hosts, constraining the effects of genome interactions on their fitness and evolution.

Abstract Flaviviruses are enveloped, positive-strand RNA viruses that cause millions of infections in the human population annually. Although Zika virus (ZIKV) had been detected in humans as early as the 1950s, its reemergence in South America in 2015 resulted in a global health crisis. While flaviviruses encode 10 proteins that can be post-translationally modified by host enzymes, little is known regarding post-translational modifications (PTMs) of the flavivirus proteome. We used mass spectrometry to comprehensively identify host-driven PTMs on the ZIKV proteome. This approach allowed us to identify 43 PTMs across 8 ZIKV proteins, including several that are highly conserved within the Flavivirus genus. Notably, we found two phosphosites on the ZIKV envelope protein that are functionally important for viral propagation and appear to regulate viral budding. Additionally, we discovered 115 host kinases that interacted with ZIKV proteins and determined that Bosutinib, an FDA-approved tyrosine kinase inhibitor that targets ZIKV interacting host kinases, impairs ZIKV growth. Thus, we have defined a high-resolution map of host-driven PTMs on ZIKV proteins as well as cellular interacting kinases, uncovered a novel mechanism of host driven-regulation of ZIKV budding, and identified an FDA-approved inhibitor of ZIKV growth.

Segmented negative-strand RNA viruses (sNSVs) include the influenza viruses, the bunyaviruses, and other major pathogens of humans, other animals and plants. The genomes of these viruses are extremely short. In response to this severe genetic constraint, sNSVs use a variety of strategies to maximise their coding potential. Because the eukaryotic hosts parasitized by sNSVs can regulate gene expression through low levels of translation initiation upstream of their canonical open reading frames (ORFs), we asked whether sNSVs could use upstream translation initiation to expand their own genetic repertoires. Consistent with this hypothesis, we showed that influenza A viruses (IAVs) and bunyaviruses were capable of upstream translation initiation. Using a combination of reporter assays and viral infections, we found that upstream translation in IAVs can initiate in two unusual ways: through non-AUG initiation in virally encoded 'untranslated' regions, and through the appropriation of an AUG-containing leader sequence from host mRNAs through viral cap-snatching, a process we termed 'start-snatching.' Finally, while upstream translation of cellular genes is mainly regulatory, for sNSVs it also has the potential to create novel viral gene products. If in frame with a viral ORF, this creates N-extensions of canonical viral proteins. If not, it allows the expression of cryptic overlapping ORFs, which we found were highly conserved in IAV and widely distributed in peribunyaviruses. Thus, by exploiting their host's capacity for upstream translation initiation, sNSVs can expand still further the coding potential of their extremely compact RNA genomes.

Clinical isolates of influenza virus produce pleiomorphic virions, ranging from small spheres to elongated filaments. The filaments are seemingly adaptive in natural infections, but their basic functional properties are poorly understood and functional studies of filaments often report contradictory results. This may be due to artefactual damage from routine laboratory handling, an issue which has been noted several times without being explored in detail. To determine whether standard laboratory techniques could damage filaments, we used immunofluorescence microscopy to rapidly and reproducibly quantity and characterise the dimensions of filaments. Most of the techniques we tested had minimal impact on filaments, but freezing to -70°C, a standard storage step before carrying out functional studies on influenza viruses, severely reduced both their concentration and median length. We noted that damage from freezing is likely to have affected most of the functional studies of filaments performed to date, and to address this we show that it can be mitigated by using the cryoprotectant DMSO. We recommend that functional studies of filaments characterise virion populations prior to analysis to ensure reproducibility, and that they use unfrozen samples if possible and cryoprotectants if not. These basic measures will support the robust functional characterisations of filaments that are required to understand their roles in natural influenza virus infections.

Abstract Single molecule fluorescence in situ hybridisation (smFISH) has become a valuable tool to investigate the mRNA expression of single cells. However, it requires a considerable amount of bioinformatic expertise to use currently available open-source analytical software packages to extract and analyse quantitative data about transcript expression. Here, we present FISHtoFigure, a new software tool developed specifically for the analysis of mRNA abundance and co-expression in QuPath-quantified, multi-labelled smFISH data. FISHtoFigure facilitates the automated spatial analysis of transcripts of interest, allowing users to analyse populations of cells positive for specific combinations of mRNA targets without the need for bioinformatics expertise. As a proof of concept and to demonstrate the capabilities of this new research tool, we have validated FISHtoFigure in multiple biological systems. We used FISHtoFigure to identify an upregulation of T-cells in the spleens of mice infected with influenza A virus, before analysing more complex data showing crosstalk between microglia and regulatory B-cells in the brains of mice infected with Trypanosoma brucei brucei . These analyses demonstrate the ease of analysing cell expression profiles using FISHtoFigure and the value of this new tool in the field of smFISH data analysis.

Abstract SARS-CoV-2 is the virus responsible for the COVID-19 pandemic, which began in late 2019 and has resulted in millions of death globally. The need to understand the pandemic means that detailed descriptions of features of this virus are now of interest to non-expert audiences. In particular, there has been much public interest in the spike protein that protrudes from the surface of the SARS-CoV-2 virus particle. The spike is the major determinant of viral infectivity and the main target for protective immune responses, and included in vaccines, and so its properties influence the impact of the pandemic on people’s lives. This protein is rapidly evolving, with mutations that enhance transmissibility or weaken vaccine protection creating new variants of concern (VOCs) and associated sub-lineages. The spread of SARS-CoV-2 VOCs has been tracked by groups such as the COVID-19 Genomics UK consortium (COG-UK). Their online mutation explorer (COG-UK/ME), which analyses and shares SARS-CoV-2 sequence data, contains information about VOCs that is designed primarily for an expert audience but is potentially of general interest during a pandemic. We wished to make this detailed information about SARS-CoV-2 VOCs more widely accessible. Previously work has shown that visualisations and interactivity can facilitate active learning and boost engagement with molecular biology topics, while animations of these topics can boost understanding on protein structure, function, and dynamics. We therefore set out to develop an educational graphical resource, the SARS-CoV-2 Spike Protein Mutation Explorer (SSPME), which contains interactive 3D molecular models and animations explaining SARS-CoV-2 spike protein variants and VOCs. We performed user-testing of the original COG-UK/ME website and of the SSPME, using a within-groups design to measure knowledge acquisition and a between-groups design to contrast the effectiveness and usability. Statistical analysis demonstrated that, when compared to the COG-UK/ME, the SSPME had higher usability and significantly improved participant knowledge confidence and knowledge acquisition. The SSPME therefore provides an example of how 3D interactive visualisations can be used for effective science communication and education on complex biomedical topics, as well as being a resource to improve the public understanding of SARS-CoV-2 VOCs.

Recent years have seen, for obvious reasons, a massive increase in awareness of the impacts that viruses have on our lives – but have also seen a massive increase in misinformation and potentially harmful misconceptions. To help young and lay audiences engage with the science of viruses, and encourage an interest in virology as a discipline, we have created a range of applications and activities. A core feature of these applications and activities is an attempt to help with visualizing virus particles themselves – helping to ground understanding in a three-dimensional mental image of what a virus 'looks' like. In this extended abstract we outline the applications and activities that have been created. We also outline how we are supporting reuse by other educators who may wish to use them in their own teaching for high-school and entry level university studies.

Abstract Cross-species transmission of avian influenza A viruses (IAVs) into humans could represent the first step of a future pandemic 1 . Multiple factors limiting the spillover and adaptation of avian IAVs in humans have been identified, but they are not sufficient to explain which virus lineages are more likely to cross the species barrier 1,2 . Here, we identified human BTN3A3 3 (butyrophilin subfamily 3 member A3) as a potent inhibitor of avian but not human IAVs. We determined that BTN3A3 is constitutively expressed in human airways and its antiviral activity evolved in primates. We show that BTN3A3 restriction acts at the early stages of virus replication by inhibiting avian IAV vRNA transcription. We identified residue 313 in the viral nucleoprotein (NP) as the genetic determinant of BTN3A3 sensitivity (313F, or rarely 313L in avian viruses) or evasion (313Y or 313V in human viruses). However, several serotypes of avian IAVs that spilled over into humans in recent decades evade BTN3A3 restriction. In these cases, BTN3A3 evasion is due to substitutions (N, H or Q) in NP residue 52 that is adjacent to residue 313 in the NP structure 4 . Importantly, we identified more than 150 avian IAV lineages with a BTN3A3-resistant genotype. In conclusion, sensitivity or resistance to BTN3A3 is another factor to consider in the risk assessment of the zoonotic potential of avian influenza viruses.

Abstract Productive infections by RNA viruses require faithful replication of the entire genome. Yet many RNA viruses also produce deletion-containing viral genomes (DelVGs), aberrant replication products with large internal deletions. DelVGs interfere with the replication of wild-type virus and their presence in patients is associated with better clinical outcomes as they. The DelVG RNA itself is hypothesized to confer this interfering activity. DelVGs antagonize replication by out-competing the full-length genome and triggering innate immune responses. Here, we identify an additionally inhibitory mechanism mediated by a new class of viral proteins encoded by DelVGs. We identified hundreds of cryptic viral proteins translated from DelVGs. These D elVG-encoded pr oteins (DPRs) include canonical viral proteins with large internal deletions, as well as proteins with novel C-termini translated from alternative reading frames. Many DPRs retain functional domains shared with their full-length counterparts, suggesting they may have activity during infection. Mechanistic studies of DPRs derived from the influenza virus protein PB2 showed that they poison replication of wild-type virus by acting as dominant-negative inhibitors of the viral polymerase. These findings reveal that DelVGs have a dual inhibitory mechanism, acting at both the RNA and protein level. They further show that DPRs have the potential to dramatically expand the functional proteomes of diverse RNA viruses.