ABSTRACT Regenerating functional new neurons in adult mammalian brains has been proven a difficult task for decades. Recent advancement in direct glia-to-neuron conversion in vivo opens a new field for neural regeneration and repair. However, this emerging new field is facing serious challenges from misuse of viral vectors to misinterpretation of conversion data. Here, we employ a variety of AAV vectors with different promoters and enhancers to demonstrate that astrocytes can be converted into neurons in a NeuroD1 dose-dependent manner in both wildtype (WT) and transgenic mice. Notably, astrocytes in WT mice were relatively easy to convert with higher conversion efficiency, whereas lineage-traced astrocytes in Aldh1l1-CreERT2 mice showed high resistance to reprogramming but were still converted into neurons after enhancing NeuroD1 expression with CMV enhancer. Furthermore, under two-photon microscope, we observed direct astrocyte-to-neuron conversion within 3 weeks of serial live imaging in the mouse cortex. We also demonstrated that high titre AAV reaching 10 13 GC/ml caused severe neuronal leakage using a variety of AAV GFAP::GFP vectors, highlighting the necessity to inject low titre AAV into healthy brains to avoid artifactual results. Together, our studies suggest that lineage-traced astrocytes can be converted into neurons but require stronger conversion force such as enhanced NeuroD1 expression. Failure to recognize the difference between WT astrocytes and lineage-traced astrocytes in terms of conversion barrier will lead to misinterpretation of data.

Abstract In vivo astrocyte-to-neuron (AtN) conversion induced by overexpression of neural transcriptional factors has great potential for neural regeneration and repair. Here, we demonstrate that a single neural transcriptional factor Dlx2 converts mouse striatal astrocytes into neurons in a dose-dependent manner. Lineage-tracing studies in Aldh1l1-CreER T2 mice confirm that Dlx2 can convert striatal astrocytes into DARPP32 + and Ctip2 + medium spiny neurons (MSNs). Time-course studies reveal a gradual conversion from astrocytes to neurons in 1 month, with a distinct intermediate state in-between astrocytes and neurons. Interestingly, when Dlx2-infected astrocytes start to lose astrocytic markers, the other local astrocytes proliferate to maintain astrocytic level in the converted areas. Unexpectedly, while Dlx2 efficiently reprograms astrocytes into neurons in the grey matter striatum, it also induces partial reprogramming of astrocytes in the white matter corpus callosum. Such partial reprogramming of white matter astrocytes is associated with neuroinflammation, which can be essentially suppressed by the addition of NeuroD1. Our results highlight the importance of investigating AtN conversion both in the grey matter and white matter in order to thoroughly evaluate therapeutic potentials. This study also unveils a critical role of anti-inflammation by NeuroD1 during AtN conversion.

Abstract Alzheimer’s disease (AD) is one of the most burdening diseases of the century with no disease-modifying treatment yet. Non-human primates (NHPs) share genetic, anatomical and physiological similarities with humans, making them an ideal model for investigating the pathogenesis and therapeutics of AD. However, the applications of NHPs in AD research have been hindered by the paucity of spontaneous or induced monkey models for AD due to their long generation time, ethical considerations and technical challenges in making genetically modified monkeys. Here we developed an AD-like NHP model by overexpressing human tau in bilateral hippocampi of adult rhesus macaque monkeys. We evaluated the pathological features of these monkeys with immunostaining, cerebrospinal fluid (CSF) analysis, magnetic resonance imaging (MRI), positron emission tomography (PET) scan, and behavioral tests. We demonstrated that after hippocampal overexpression of human tau, the rhesus macaque monkeys displayed multiple pathological features of AD, including neurofibrillary tangle formation, neuronal loss, hippocampal atrophy, neuroinflammation, Aβ clearance deficit, blood vessel damage and cognitive decline. This work establishes a human tau-induced AD-like NHP model that may facilitate mechanistic studies and therapeutic treatments for AD.

ABSTRACT Regenerating functional new neurons in the adult mammalian central nervous system (CNS) has been proven to be very challenging due to the inability of neurons to divide and repopulate themselves after neuronal loss. In contrast, glial cells in the CNS can divide and repopulate themselves under injury or disease conditions. Therefore, many groups around the world have been able to utilize internal glial cells to directly convert them into neurons for neural repair. We have previously demonstrated that ectopic expression of NeuroD1 in dividing glial cells can directly convert reactive glial cells into neurons. However, Wang et al. recently posted an article in bioRxiv challenging the entire field of in vivo glia-to-neuron conversion after using one single highly toxic dose of AAV (2×10 13 gc/ml, 1 μl) in the mouse cortex, producing artifacts that are very difficult to interpret. We present data here that reducing AAV dosage to safe level will avoid artifacts caused by toxic dosage. We also demonstrate with Aldh1l1-CreER T2 and Ai14 reporter mice that lineage-traced astrocytes can be successfully converted into NeuN + neurons after infected by AAV5 GFAP::NeuroD1. Retroviral expression of NeuroD1 further confirms our previous findings that dividing glial cells can be converted into neurons. Together, the incidence of Wang et al. sends an alarming signal to the entire in vivo reprogramming field that the dosage of viral vectors is a critical factor to consider when designing proper experiments. For AAV, we recommend a relatively safe dose of 1×10 10 - 1×10 12 gc/ml (~1 μl) in the rodent brain for cell conversion experiments addressing basic science questions. For therapeutic purpose under injury or diseased conditions, AAV dosage needs to be adjusted through a series of dose finding experiments. Moreover, we recommend that the AAV results are further verified with retroviruses that mainly express transgenes in dividing glial cells in order to draw solid conclusions.