The human Rad50 protein, classified as a structural maintenance of chromosomes (SMC) family member, is complexed with Mre11 (R/M) and has important functions in at least two distinct double-strand break repair pathways. To find out what the common function of R/M in these pathways might be, we investigated its architecture. Scanning force microscopy showed that the complex architecture is distinct from the described SMC family members. R/M consisted of two highly flexible intramolecular coiled coils emanating from a central globular DNA binding domain. DNA end-bound R/M oligomers could tether linear DNA molecules. These observations suggest that a unified role for R/M in multiple aspects of DNA repair and chromosome metabolism is to provide a flexible, possibly dynamic, link between DNA ends.

Lysine acetylation of histones defines the epigenetic status of human embryonic stem cells and orchestrates DNA replication, chromosome condensation, transcription, telomeric silencing, and DNA repair. A detailed mechanistic explanation of these phenomena is impeded by the limited availability of homogeneously acetylated histones. We report a general method for the production of homogeneously and site-specifically acetylated recombinant histones by genetically encoding acetyl-lysine. We reconstitute histone octamers, nucleosomes, and nucleosomal arrays bearing defined acetylated lysine residues. With these designer nucleosomes, we demonstrate that, in contrast to the prevailing dogma, acetylation of H3 K56 does not directly affect the compaction of chromatin and has modest effects on remodeling by SWI/SNF and RSC. Single-molecule FRET experiments reveal that H3 K56 acetylation increases DNA breathing 7-fold. Our results provide a molecular and mechanistic underpinning for cellular phenomena that have been linked with K56 acetylation.

Electrical transport measurements are reported for double-stranded DNA molecules located between nanofabricated electrodes. We observe the absence of any electrical conduction through these DNA-based devices, both at the single-molecule level as well as for small bundles of DNA. We obtain a lower bound of 10 TΩ for the resistance of a DNA molecule at length scales larger than 40 nm. It is concluded that DNA is insulating. This conclusion is based on an extensive set of experiments in which we varied key parameters such as the base-pair sequence [mixed sequence and homogeneous poly(dG)⋅poly(dC)], length between contacts (40–500 nm), substrate (SiO2 or mica), electrode material (gold or platinum), and electrostatic doping fields. Discrepancies with other reports in the literature are discussed.

Abstract Single-molecule FRET (smFRET) has become an established tool to study biomolecular structure and dynamics in vitro and in live cells. We performed a worldwide blind study involving 19 labs to assess the uncertainty of FRET experiments for proteins with respect to the measured FRET efficiency histograms, determination of distances, and the detection and quantification of structural dynamics. Using two protein systems that undergo distinct conformational changes, we obtained an uncertainty of the FRET efficiency of less than ± 0.06, corresponding to an interdye distance precision of ≤ 0.2 nm and accuracy of ≤ 0.5 nm. We further discuss the limits for detecting distance fluctuations with sensitivity down to ≲ 10% of the Förster distance and provide guidelines on how to detect potential dye perturbations. The ability of smFRET experiments to simultaneously measure distances and avoid averaging of conformational dynamics slower than the fluorescence lifetime is unique for dynamic structural biology.

Implementation of combined microscopy methods provides valuable information across various scientific applications. However, aligning the datasets and finding the correct point correspondence poses a challenge, especially for large, randomly distributed point sets that are subject to positional errors and missing points. Here, we provide a three-step procedure to perform point set registration, which can be applied to datasets with millions of points and stays robust even when only 10% of the points correspond. In the first global step, the scaling and rotation parameters for the imaging systems are determined once on a smaller calibration dataset using a geometric hashing algorithm. When the global transformation is known, full experimental datasets can be registered by performing step two: a course registration using cross-correlation, and step three: a precise registration to fine-tune the transformation. After these three steps, point correspondence is determined by setting a distance threshold based on a statistical model of random point sets that additionally provides the matching error. We have demonstrated its successful implementation in coupling fluorescence and sequencing methodologies. To enable wide application of these point set registration and correspondence algorithms we provide a python library called MatchPoint.

ABSTRACT Over the last two decades, developments in single-molecule microscopy (SMM) have enabled imaging and tracking of individual, fluorescently labelled proteins in biological systems, and most of these studies have focused on the analysis of protein mobility patterns inside cultured cells. In the present study, SMM was applied in vivo , using the zebrafish embryo model. We studied the protein dynamics of the membrane protein H-Ras, mutants of this protein, and its membrane-anchoring domain, C10H-Ras, in epidermal cells of living two-day-old embryos, using a total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) setup. For all proteins studied, our results consistently confirm the presence of a fast- and a slow-diffusing subpopulations of molecules, which both confine to microdomains within the plasma membrane. Although the mobility patterns of H-Ras, mutants of this proteins and its membrane-anchoring domain were remarkably similar, the constitutively active H-Ras mutant, H-Ras V12 , exhibited significantly higher diffusion rates than the wild-type H-Ras and its inactive mutant, H-Ras N17 . Ultimately, we characterized variability in our data obtained using the zebrafish embryo model and demonstrated that differences between cells within the same embryo are the largest source of variation in our data. Our findings are in line with a model in which the cellular architecture of individual cells within a tissue determine the mobility of H-Ras proteins anchored in the plasma membrane cytoplasmic leaflet. Thereby, our results underline the growing importance of performing SMM imaging in vivo in order to better understand factors influencing the protein dynamics in an intact living organism. SUMMARY STATEMENT By application of single-molecule microscopy to living zebrafish embryos, factors altering the in vivo dynamics of H-Ras proteins in epidermal cells were analyzed.

Abstract Telomeres, the ends of eukaryotic chromosomes, play pivotal roles in ageing and cancer and are targets of DNA damage and response. However, little is known about the structure and organization of telomeric chromatin at the molecular level. We used electron microscopy and single-molecule magnetic tweezers to characterize well-defined telomeric chromatin fibers of kilobasepair length. The cryo-EM structure of the compact telomeric tetranucleosome revealed a novel columnar folding, unusually short nucleosome repeat length of ∼132bp and the role of the histone N-terminal tails in stabilizing this structure. This is the first near-high resolution structure of chromatin with a native DNA sequence. The columnar structure exposes the DNA, making them susceptible to DNA damage. The telomeric tetranucleosome also exists in an alternative well-defined state, with one nucleosome open, accessible to protein factors. This suggests that protein factors, which plays a role in maintaining telomeres, can bind to telomeric chromatin in its compact heterochromatic form. The features of the telomeric chromatin structure reveals important insights of significant relevance for telomere function in vivo that provides information on mechanisms of nucleosome recognition by chromatin factors

ABSTRACT Developments in fluorescence microscopy techniques have enabled imaging of individual fluorescently labelled proteins in biological systems, and in the current study, a single-molecule microscopy (SMM) technique has been applied in vivo , using the zebrafish embryo model. We have used multifocal two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEFM) to study the dynamics of a GFP-fused H-Ras membrane-anchoring domain, GFP-C10H-Ras, in the epidermal cells of living embryos. In previous studies, a fast and a slow diffusing population of GFP-C10H-Ras molecules had been found. The application of the multifocal 2PEFM technique enabled us to focus on the slow diffusing population, which appears to occur in clusters that diffuse within microdomains of the epidermal cell membranes. Based on their mobility on a short timescale (≤ 1s) we could distinguish between a subpopulation that was diffusing and one that was virtually immobile. Owing to the multifocal 2PEFM imaging mode, we were able to dramatically reduce photobleaching which enabled us to follow the GFP-C10H-Ras particles over a prolonged time (> 3 s) and reconstruct their molecular trajectories of the diffusing subpopulation. These trajectories exhibited that the C10H-Ras particles continuously switch between a diffusing state and brief bursts of increased diffusion. As a result, they display an anomalous mobility pattern that can be referred to as hop diffusion. Taken together, this study demonstrates that multifocal 2PEFM offers a powerful approach to studying individual particles for prolonged periods of time, and that using this approach we were able to uncover the hopping behavior of GFP-C10H-Ras. SUMMARY STATEMENT By application of the two-photon excitation single-molecule microscopy to living zebrafish embryos, anomalous diffusion modes of individual H-Ras membrane anchors in epidermal cells were found.

Many single-molecule biophysical techniques rely on nanometric tracking of microbeads to obtain quantitative information about the mechanical properties of biomolecules such as chromatin fibers. Their three-dimensional position can be resolved by holographic analysis of the diffraction pattern in wide-field imaging. Fitting this diffraction pattern to Lorentz Mie scattering theory yields the bead position with nanometer accuracy in three dimensions but is computationally expensive. Real-time multiplexed bead tracking therefore requires a more efficient tracking method. Here, we introduce 3D phasor tracking, a fast and robust bead tracking algorithm with nanometric localization accuracy in a z-range of over 10 μm. The algorithm is based on a 2D cross-correlation using Fast Fourier Transforms with computer-generated reference images, yielding a processing rate of up to 10.000 regions of interest per second. We implemented the technique in magnetic tweezers and tracked the 3D position of over 100 beads in real-time on a generic CPU. Its easy implementation, efficiency, and robustness can improve multiplexed biophysical bead tracking applications, especially where high throughput is required.