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D.C. Chan
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Revisiting the impact of synthetic ORF sequences on engineered LINE-1 retrotransposition

D.C. Chan et al.Aug 29, 2022
Abstract The retrotransposon Long Interspersed Element 1 (L1) contains adenosine rich ORFs, a characteristic that limits its expression in mammalian cells. A synthetic mouse L1 (smL1) with ORF adenosine content decreased from 40% to 26% showed increased mRNA expression and retrotransposed far more efficiently than the native parental element, L1spa (1). Here, we observe two nonsynonymous substitutions between the L1spa and smL1 ORF1 sequences, and note that the smL1 3’UTR lacks a conserved guanosine-rich region (GRR) which could potentially take on a G-quadruplex secondary structure. We find that the combined effect of a single amino acid change and the GRR 3’UTR deletion, rather than synthetic ORF sequences, accounts for the increase in smL1 retrotransposition efficiency over L1spa. Furthermore, we demonstrate that the position of the GRR within the L1 reporter construct impacts retrotransposition efficiency. Our results prompt a reevaluation of synthetic L1 activity and suggest native mouse L1 mobility has in some cases been underestimated in engineered retrotransposition assays. Author Summary L1 retrotransposons are mobile DNA elements or “jumping genes” that can copy- and-paste their sequences to new locations in the host genome. The jumping ability, or retrotransposition efficiency, of individual L1 elements can be evaluated using a cultured cell assay in which the L1 is tagged in its 3’ untranslated region (3’UTR) with a reporter gene that becomes expressed upon successful retrotransposition. In a previous study, authors Han and Boeke reported that the retrotransposition efficiency of a mouse L1 element could be enhanced dramatically by synthetically increasing the GC content of the L1 ORFs without changing their amino acid sequence. Curiously, a similarly constructed synthetic human L1 achieved only a modest increase in retrotransposition efficiency over the native element. Here, we find that two coding changes and partial deletion of the mouse L1 3’UTR sequence which occurred during construction of the synthetic mouse L1 reporter actually are responsible for the increased jumping of this construct. We also find that changing the placement as well as the presence of this deleted 3’UTR region within the reporter construct determines its impact on engineered retrotransposition efficiency. Together, our study reconciles the disparate impacts of synthetic sequences upon human and mouse L1 retrotransposition efficiency, prompts a reconsideration of numerous studies using synthetic L1 constructs, and will inform the ongoing use of synthetic and natural mouse L1 reporter constructs in vivo and in vitro.
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Mouse L1s fade with age: a methylation-enforced mechanism for attenuation of L1 retrotransposition potential

Patricia Gerdes et al.Aug 6, 2022
ABSTRACT Mice harbor ∼2,800 intact copies of the retrotransposon Long Interspersed Element 1 (L1). The in vivo retrotransposition capacity of an L1 copy is defined by both its sequence integrity and epigenetic status, including DNA methylation of the monomeric units constituting young mouse L1 promoters. Locus-specific L1 methylation dynamics during development may therefore elucidate and explain spatiotemporal niches of endogenous retrotransposition, but remain unresolved. Here, we interrogate the retrotransposition efficiency and epigenetic fate of source (donor) L1s, identified as mobile in vivo . We demonstrate that promoter monomer loss consistently attenuates the relative retrotransposition potential of their offspring (daughter) L1 insertions. We also observe that most donor/daughter L1 pairs are efficiently methylated upon differentiation in vivo and in vitro . We employ Oxford Nanopore Technologies (ONT) long-read sequencing to resolve L1 methylation genome-wide and with locus-specific resolution, revealing a distinctive “smile” pattern in methylation levels across the L1 promoter region and thereby elucidating a molecular mechanism potentially underpinning L1 promoter shortening. Together, our results offer a novel perspective on the interplay between epigenetic repression, L1 evolution, and genome stability.
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Hematopoietic Tet2 inactivation enhances the response to checkpoint blockade immunotherapy

Robert Vanner et al.Sep 11, 2024
Somatic mutations inactivating TET2 are among the most common drivers of clonal hematopoiesis (CH). While TET2 inactivation is associated with monocyte-derived inflammation and improved chimeric antigen-receptor-T cell function, its impact on immunotherapy response is unknown. In our mouse model, hematopoietic Tet2 mutation enhanced immune checkpoint blockade (ICB) response. Enhanced ICB response with Tet2 mutation required phagocytes, CD4 and CD8 T cells. Mechanistically, in Tet2-mutant tumor-infiltrating leukocytes (TILs), ICB preferentially induced anti-tumor states and restricted cell states linked to tumor progression. Tet2-mutant monocytes activated costimulatory programs, while Tet2-mutant T cells showed enhanced T cell memory signatures, lesser exhaustion and decreased regulatory phenotype. Our murine data was clinically relevant, since we found that melanomas from patients with TET2 driver mutation-CH (TET2-CH) showed enhanced immune infiltration, T cell activation, and T cell memory programs. In melanoma patients treated with ICB, TET2-CH was associated with 6-fold greater odds of clinical benefit. Collectively, our data establishes that hematopoietic Tet2 inactivation primes leukocytes for anti-tumor states associated with immunotherapy response and provides a potential biomarker for personalized therapy.