Abstract Quantitative proteomics is an indispensable tool in life science research. However, there is a lack of reference materials for evaluating the reproducibility of label-free liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)-based measurements among different instruments and laboratories. We developed the Quartet as a proteome reference material with built-in truths, and distributed the same aliquots to 15 laboratories with nine conventional LC-MS/MS platforms across six cities in China. Relative abundance of over 12,000 proteins on 816 MS files were obtained and compared for reproducibility among the instruments and laboratories to ultimately generate proteomics benchmark datasets. There was a wide dynamic range of proteomes spanning ~7 orders of magnitude (10 1 –10 8 copies/cell), and the injection order had marked effects on quantitative instead of qualitative. Overall, the Quartet offers valuable standard materials and data resources for improving the quality control of proteomic analyses as well as the reproducibility and reliability of research findings.

Abstract Analysis of extracellular vesicles (EVs) is a promising noninvasive liquid biopsy approach for breast cancer (BC) detection, prognosis, and therapeutic monitoring. A comprehensive understanding of the characteristics and proteomic composition of BC-specific EVs from human samples is required to realize the potential of this strategy. In this study, we applied a mass spectrometry-based, data-independent acquisition (DIA) proteomic approach to characterize human serum EVs derived from patients with BC (n = 126) and healthy donors (HDs, n = 70) in a discovery cohort and validated the findings in five independent cohorts. Examination of the EV proteomes enabled construction of specific EV protein classifiers for diagnosing BC and distinguishing patients with metastatic disease. Of note, TALDO1 was found to be an EV biomarker of distant metastasis of BC. In vitro and in vivo analysis confirmed the role of TALDO1 in stimulating BC invasion and metastasis. Finally, high-throughput molecular docking and virtual screening of a library consisting of 271,380 small molecules identified a potent TALDO1 allosteric inhibitor, AO-022, which could inhibit BC migration in vitro and tumor progression in vivo. Together, this work elucidates the proteomic alterations in the serum EVs of BC patients to guide development of improved diagnosis, monitoring, and treatment strategies.

Abstract There is a lack of comprehensive understanding of breast cancer (BC) specific sEVs characteristics and composition on BC unique proteomic information from human samples. Here, we interrogated the proteomic landscape of sEVs in 167 serum samples from patients with BC, benign mammary disease (BD) and from healthy donors (HD). The analysis provides a comprehensive landscape of serum sEVs with totally 9,589 proteins identified, considerably expanding the panel of sEVs markers. Of note, serum BC-sEVs protein signatures were distinct from those of BD and HD, representing stage- and molecular subtype-specific patterns. We constructed specific sEVs protein identifiers that could serve as a liquid biopsy tool for diagnosis and classification of BC from benign mammary disease, molecular subtypes, as well as assessment of lymph node metastasis. We also identified 11 potential survival biomarkers for distant metastasis. This work may provide reference value for the accurate diagnosis and monitoring of BC progression using serum sEVs.

Cellular senescence has been viewed as an irreversible cell cycle arrest that acts to prevent cancer. Recent studies discovered widespread shortening of 3′ untranslated regions (3′ UTRs) by alternative cleavage and polyadenylation (APA) in cancer cells. However, the role of APA in the process of cellular senescence remains elusive. We thus applied our published PA-seq method to investigate APA regulation in different passages of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) from rats of different ages. We found that genes in senescent cells tended to use distal poly(A) sites (pAs). An independent RNA-seq analysis gave rise to the same conclusion. Interestingly, the level of expression of genes preferred to use distal pAs in senescent MFEs and VSMCs tended to decrease. More importantly, genes that preferred to use distal pAs in senescent MFEs and VSMCs were enriched in common senescence-related pathways such as ubiquitin-mediated proteolysis and cell cycle. Further, the longer 3′ UTRs of the genes that tended to use distal pAs introduced more conserved binding sites of senescence-related microRNAs (miRNAs) and RNA binding proteins (RBPs). Noteworthy, the expression level of core factors involved in cleavage and the polyadenylation tended to decrease, while those factors showed opposite trend in cancer cells. In summary, we showed, for the first time, that APA is a hidden layer of post-transcriptional gene expression regulation involved in cellular senescence.

ABSTRACT Background Cellular senescence has historically been viewed as an irreversible cell cycle arrest that acts to prevent cancer. Recent discoveries demonstrated that cellular senescence also played a vital role in normal embryonic development, tissue renewal and senescence-related diseases. Alternative cleavage and polyadenylation (APA) is an important layer of post-transcriptional regulation, which has been found playing an essential role in development, activation of immune cells and cancer progression. However, the role of APA in the process of cellular senescence remains unclear. Materials and Methods We applied high-throughput paired-end polyadenylation sequencing (PA-seq) and strand-specific RNA-seq sequencing technologies, combined systematic bioinformatics analyses and experimental validation to investigate APA regulation in different passages of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and in aortic vascular smooth muscle cells of rats (VSMCs) with different ages. Results Based on PA-seq, we found that genes in senescent cells tended to use distal pA sites and an independent bioinformatics analysis for RNA-seq drew the same conclusion. In consistent with these global results, both the number of genes significantly preferred to use distal pAs in senescent MEFs and VSMCs were significantly higher than genes tended to use proximal pAs. Interestingly, the expression levels of genes preferred to use distal pAs in senescent MFEs and VSMCs tended to decrease, while genes with single pAs did not show such trend. More importantly, genes preferred to use distal pAs in senescent MFEs and VSMCs were both enriched in common senescence-related pathways, including ubiqutin mediated proteolysis, regulation of actin cytoskeleton, cell cycle and wnt signaling pathway. By cis-elements analyses, we found that the longer 3'UTR; UTRs of the genes tended to use distal pAs progressively can introduce more conserved binding sites of senescence-related miRNAs and RBPs. Furthermore, 375 genes with progressive 3'UTR; UTR lengthening during MEF senescence tended to use more strong and conserved polyadenylation signal (PAS) around distal pA sites and this was accompanied the observation that expression level of core factors involved in cleavage and polyadenylation complex was decreased. Conclusions Our finding that genes preferred distal pAs in senescent mouse and rat cells provide new insights for aging cells' posttranscriptional gene regulation in the view of alternative polyadenylation given senescence response was thought to be a tumor suppression mechanism and more genes tended to use proximal pAs in cancer cells. In short, APA was a hidden layer of post-transcriptional gene expression regulation involved in cellular senescence.

Abstract Colorectal cancer (CRC) is the second most common malignant tumor world-wide. Analysis of the changes that occur during CRC progression could provide insights into the molecular mechanisms driving CRC development and identify improved treatment strategies. Here, we performed an integrated multi-omics analysis of 435 trace-tumor-samples from 148 colorectal cancer (CRC) patients, covering non-tumor (NT), intraepithelial neoplasia (IEN), infiltration (IFT), and advanced-stage CRC (A-CRC) phases. Proteogenomics analyses demonstrated that KRAS and BRAF mutations were mutually exclusive and elevated oxidation phosphorylation in the IEN phase. Chr17q loss and chr20q gain were also mutually exclusive, occurred predominantly in the IEN and IFT phases, respectively, and impacted the cell cycle. Mutation of TP53 was frequent in the A-CRC phase and associated with tumor microenvironment, including increased extracellular matrix rigidity and stromal infiltration. Analysis of the profiles of CRC based on CMS and CRIS classifications revealed the progression paths of each subtype and indicated that microsatellite instability was associated with specific subtype classifications. Additional comparison of molecular characteristics of CRC based on location showed that ANKRD22 amplification by chr10q23.31 gain enhanced glycolysis in the right-sided CRC. The AOM/DSS-induced CRC carcinogenesis mouse model in mice indicated that DDX5 deletion due to chr17q loss promoted CRC development, consistent with the findings from the patient samples. Collectively, this study provides an informative resource for understanding the driving events of different stages of CRC and identifying the potential therapeutic targets.