Abstract History, chance, and selection are the fundamental factors that drive and constrain evolution. We designed evolution experiments to disentangle and quantify effects of these forces on the evolution of antibiotic resistance. History was established by prior antibiotic selection of the pathogen Acinetobacter baumannii in both structured and unstructured environments, selection occurred in increasing concentrations of new antibiotics, and chance differences arose as random mutations among replicate populations. The effects of history were reduced by increasingly strong selection in new drugs, but not erased, at times producing important contingencies. Selection in structured environments constrained resistance to new drugs and led to frequent loss of resistance to the initial drug. This research demonstrates that despite strong selective pressures of antibiotics leading to genetic parallelism, history can etch potential vulnerabilities to orthogonal drugs.

Abstract Many bacteria cycle between sessile and motile forms in which they must sense and respond to internal and external signals to coordinate appropriate physiology. Maintaining fitness requires genetic networks that have been honed in variable environments to integrate these signals. The identity of the major regulators and how their control mechanisms evolved remain largely unknown in most organisms. During four different evolution experiments with the opportunist betaproteobacterium Burkholderia cenocepacia in a biofilm model, mutations were most frequently selected in the conserved gene rpfR . RpfR uniquely integrates two major signaling systems -- quorum sensing and the motile-sessile switch mediated by cyclic-d-GMP -- by two domains that sense, respond to, and control synthesis of the autoinducer cis-2-dodecenoic acid (BDSF). The BDSF response in turn regulates activity of diguanylate cyclase and phosphodiesterase domains acting on cyclic-di-GMP. Parallel adaptive substitutions evolved in each of these domains to produce unique life history strategies by regulating cyclic-di-GMP levels, global transcriptional responses, biofilm production, and polysaccharide composition. These phenotypes translated into distinct ecology and biofilm structures that enabled mutants to coexist and produce more biomass than expected from their constituents grown alone. This study shows that when bacterial populations are selected in environments challenging the limits of their plasticity, the evolved mutations not only alter genes at the nexus of signaling networks but also reveal the scope of their regulatory functions. Significance statement Many organisms including bacteria live in fluctuating environments requiring attachment and dispersal. These lifestyle decisions require multiple external signals to be processed by several genetic pathways, but how they are integrated is largely unknown. We conducted multiple evolution experiments totaling >20,000 generations with Burkholderia cenocepacia populations grown in a model of the biofilm life cycle and identified parallel mutations in one gene, rpfR , that is a conserved central regulator. Because RpfR has multiple sensor and catalytic domains, different mutations can produce different ecological strategies that can coexist and even increase net growth. This study demonstrates that a single gene may coordinate complex life histories in biofilm-dwelling bacteria and that selection in defined environments can reshape niche breadth by single mutations.

Organismal stoichiometry refers to the relative proportion of chemical elements in the biomass of organisms, and it can have important effects on ecological interactions from population to ecosystem scales. Although stoichiometry has been studied extensively from an ecological perspective, little is known about rates and directions of evolutionary changes in elemental composition in response to nutrient limitation. We measured carbon, nitrogen, and phosphorus content of Escherichia coli evolved under controlled carbon-limited conditions for 50,000 generations. The bacteria evolved higher relative nitrogen and phosphorus content, consistent with selection for increased use of the more abundant elements. Total carbon assimilated also increased, indicating more efficient use of the limiting element. Altogether, our study shows that stoichiometry evolved over a relatively short time-period, and that it did so in a predictable direction given the carbon-limiting environment.

Natural environments are rarely static; rather selection can fluctuate on time scales ranging from hours to centuries. However, it is unclear how adaptation to fluctuating environments differs from adaptation to constant environments at the genetic level. For bacteria, one key axis of environmental variation is selection for planktonic or biofilm modes of growth. We conducted an evolution experiment with Burkholderia cenocepacia , comparing the evolutionary dynamics of populations evolving under constant selection for either biofilm formation or planktonic growth with populations in which selection fluctuated between the two environments on a weekly basis. Populations evolved in the fluctuating environment shared many of the same genetic targets of selection as those evolved in constant biofilm selection, but were genetically distinct from the constant planktonic populations. In the fluctuating environment, mutations in the biofilm-regulating genes wspA and rpfR rose to high frequency in all replicate populations. A mutation in wspA first rose rapidly and nearly fixed during the initial biofilm phase but was subsequently displaced by a collection of rpfR mutants upon the shift to the planktonic phase. The wspA and rpfR genotypes coexisted via negative frequency-dependent selection around an equilibrium frequency that shifted between the environments. The maintenance of coexisting genotypes in the fluctuating environment was unexpected. Under temporally fluctuating environments coexistence of two genotypes is only predicted under a narrow range of conditions, but the frequency-dependent interactions we observed provide a mechanism that can increase the likelihood of coexistence in fluctuating environments.

In a long-term evolution experiment with Escherichia coli, bacteria in one of twelve populations evolved the ability to consume citrate, a previously unexploited resource in a glucose-limited medium. This innovation led to the frequency-dependent coexistence of citrate-consuming (Cit+) and non-consuming (Cit–) ecotypes, with Cit– bacteria persisting on the exogenously supplied glucose as well as other carbon molecules released by the Cit+ bacteria. After more than 10,000 generations of coexistence, however, the Cit– lineage went extinct; cells with the Cit– phenotype dropped to levels below detection, and the Cit– clade could not be detected by molecular assays based on its unique genotype. We hypothesized that this extinction event was a deterministic outcome of evolutionary change within the population, specifically the appearance of a more-fit Cit+ ecotype that competitively excluded the Cit– ecotype. We tested this hypothesis by re-evolving the population from one frozen sample taken just prior to the extinction and from another sample taken several thousand generations earlier, in each case for 500 generations and with 20-fold replication. To our surprise, the Cit– type did not go extinct in any of these replays, and Cit– cells also persisted in a single replicate that was propagated for 3,000 generations. Even more unexpectedly, we showed that the Cit– ecotype could reinvade the Cit+ population after its extinction. Taken together, these results indicate that the extinction of the Cit– ecotype was not a deterministic outcome driven by competitive exclusion by the Cit+ ecotype. The extinction also cannot be explained by demographic stochasticity, as the population size of the Cit– ecotype should have been many thousands of cells even during the daily transfer events. Instead, we infer that the extinction must have been caused by a rare chance event in which some aspect of the experimental conditions was inadvertently perturbed.

Many populations live in environments subject to frequent biotic and abiotic changes. Nonetheless, it is interesting to ask whether an evolving population's mean fitness can increase indefinitely, and potentially without any limit, even in a constant environment. A recent study showed that fitness trajectories of Escherichia coli populations over 50,000 generations were better described by a power-law model than by a hyperbolic model. According to the power-law model, the rate of fitness gain declines over time but fitness has no upper limit, whereas the hyperbolic model implies a hard limit. Here, we examine whether the previously estimated power-law model predicts the fitness trajectory for an additional 10,000 generations. To that end, we conducted more than 1100 new competitive fitness assays. Consistent with the previous study, the power-law model fits the new data better than the hyperbolic model. We also analysed the variability in fitness among populations, finding subtle, but significant, heterogeneity in mean fitness. Some, but not all, of this variation reflects differences in mutation rate that evolved over time. Taken together, our results imply that both adaptation and divergence can continue indefinitely-or at least for a long time-even in a constant environment.

Evolution of a novel function can greatly alter the effects of an organism on its environment. These environmental changes can, in turn, affect the further evolution of that organism and any coexisting organisms. We examine these effects and feedbacks following evolution of a novel function in the long-term evolution experiment (LTEE) with Escherichia coli. A characteristic feature of E. coli is its inability to consume citrate aerobically. However, that ability evolved in one of the LTEE populations. In this population, citrate-utilizing bacteria (Cit+) coexisted stably with another clade of bacteria that lacked the capacity to utilize citrate (Cit−). This coexistence was shaped by the evolution of a cross-feeding relationship in which Cit+ cells released the dicarboxylic acids succinate, fumarate, and malate into the medium, and Cit− cells evolved improved growth on these carbon sources, as did the Cit+ cells. Thus, the evolution of citrate consumption led to a flask-based ecosystem that went from a single limiting resource, glucose, to one with five resources either shared or partitioned between two coexisting clades. Our findings show how evolutionary novelties can change environmental conditions, thereby facilitating diversity and altering both the structure of an ecosystem and the evolutionary trajectories of coexisting organisms.