Although the cerebral cortex is organized into six excitatory neuronal layers, it is unclear whether glial cells show distinct layering. In the present study, we developed a high-content pipeline, the large-area spatial transcriptomic (LaST) map, which can quantify single-cell gene expression in situ. Screening 46 candidate genes for astrocyte diversity across the mouse cortex, we identified superficial, mid and deep astrocyte identities in gradient layer patterns that were distinct from those of neurons. Astrocyte layer features, established in the early postnatal cortex, mostly persisted in adult mouse and human cortex. Single-cell RNA sequencing and spatial reconstruction analysis further confirmed the presence of astrocyte layers in the adult cortex. Satb2 and Reeler mutations that shifted neuronal post-mitotic development were sufficient to alter glial layering, indicating an instructive role for neuronal cues. Finally, astrocyte layer patterns diverged between mouse cortical regions. These findings indicate that excitatory neurons and astrocytes are organized into distinct lineage-associated laminae. A new spatial transcriptomic approach reveals astrocyte heterogeneity across layers of the mammalian cerebral cortex. Astrocytes diversify into superficial-, mid- and deep-layer subtypes distinct from neuronal laminae, yet instructed by neuronal cues.

Sensory computations performed in the neocortex involve layer six (L6) cortico-cortical (CC) and cortico-thalamic (CT) signaling pathways. Developing an understanding of the physiological role of these circuits requires dissection of the functional specificity and connectivity of the underlying individual projection neurons. By combining whole-cell recording from identified L6 principal cells in the mouse primary visual cortex (V1) with modified rabies virus-based input mapping, we have determined the sensory response properties and upstream monosynaptic connectivity of cells mediating the CC or CT pathway. We show that CC-projecting cells encompass a broad spectrum of selectivity to stimulus orientation and are predominantly innervated by deep layer V1 neurons. In contrast, CT-projecting cells are ultrasparse firing, exquisitely tuned to orientation and direction information, and receive long-range input from higher cortical areas. This segregation in function and connectivity indicates that L6 microcircuits route specific contextual and stimulus-related information within and outside the cortical network.

Abstract Quantitatively characterising brain-wide connectivity of neural circuits is of vital importance in understanding the function of the mammalian cortex. Here we have designed an analytical approach to examine data from hierarchical segmentation ontologies, and applied it in the comparison of long-range presynaptic connectivity onto excitatory and inhibitory neurons in layer 2/3 (L2/3) of mouse primary visual cortex (V1). We find that long-range connections onto these two general cell classes in L2/3 originate from highly similar brain regions, and in similar proportions, when compared to input to layer 6. These anatomical data suggest that distal information received by excitatory and inhibitory networks is highly homogenous in L2/3.

This in vivo study shows that both intrinsic and sensory-evoked synaptic properties of layer 2/3 neurons in mouse visual cortex are modified by ongoing visual input. Following visual deprivation, intrinsic properties are significantly altered, although orientation selectivity across the population remains unchanged. We therefore suggest that cortical cells adjust their intrinsic excitability in an activity-dependent manner to compensate for changes in synaptic drive and maintain sensory network function.

During organogenesis, patterns and gradients of gene expression underlie organization and diversified cell specification to generate complex tissue architecture. While the cerebral cortex is organized into six excitatory neuronal layers, it is unclear whether glial cells are diversified to mimic neuronal laminae or show distinct layering. To determine the molecular architecture of the mammalian cortex, we developed a high- content pipeline that can quantify single-cell gene expression in situ. The Large-area Spatial Transcriptomic (LaST) map confirmed expected cortical neuron layer organization and also revealed a novel neuronal identity signature. Screening 46 candidate genes for astrocyte diversity across the cortex, we identified grey matter superficial, mid and deep astrocyte identities in gradient layer patterns that were distinct from neurons. Astrocyte layers formed in early postnatal cortex and mostly persisted in adult mouse and human cortex. Mutations that shifted neuronal post-mitotic identity or organization were sufficient to alter glial layering, indicating an instructive role for neuronal cues. In normal mouse cortex, astrocyte layer patterns showed area diversity between functionally distinct cortical regions. These findings indicate that excitatory neurons and astrocytes cells are organized into distinct lineage-associated laminae, which give rise to higher order neuroglial complexity of cortical architecture.