Whole-genome sequencing projects are increasingly populating the tree of life and characterizing biodiversity1–4. Sparse taxon sampling has previously been proposed to confound phylogenetic inference5, and captures only a fraction of the genomic diversity. Here we report a substantial step towards the dense representation of avian phylogenetic and molecular diversity, by analysing 363 genomes from 92.4% of bird families—including 267 newly sequenced genomes produced for phase II of the Bird 10,000 Genomes (B10K) Project. We use this comparative genome dataset in combination with a pipeline that leverages a reference-free whole-genome alignment to identify orthologous regions in greater numbers than has previously been possible and to recognize genomic novelties in particular bird lineages. The densely sampled alignment provides a single-base-pair map of selection, has more than doubled the fraction of bases that are confidently predicted to be under conservation and reveals extensive patterns of weak selection in predominantly non-coding DNA. Our results demonstrate that increasing the diversity of genomes used in comparative studies can reveal more shared and lineage-specific variation, and improve the investigation of genomic characteristics. We anticipate that this genomic resource will offer new perspectives on evolutionary processes in cross-species comparative analyses and assist in efforts to conserve species. A dataset of the genomes of 363 species from the Bird 10,000 Genomes Project shows increased power to detect shared and lineage-specific variation, demonstrating the importance of phylogenetically diverse taxon sampling in whole-genome sequencing.

Ancient DNA research has been revolutionized following development of next-generation sequencing platforms. Although a number of such platforms have been applied to ancient DNA samples, the Illumina series are the dominant choice today, mainly because of high production capacities and short read production. Recently a potentially attractive alternative platform for palaeogenomic data generation has been developed, the BGISEQ-500, whose sequence output are comparable with the Illumina series. In this study, we modified the standard BGISEQ-500 library preparation specifically for use on degraded DNA, then directly compared the sequencing performance and data quality of the BGISEQ-500 to the Illumina HiSeq2500 platform on DNA extracted from 8 historic and ancient dog and wolf samples. The data generated were largely comparable between sequencing platforms, with no statistically significant difference observed for parameters including level (P = 0.371) and average sequence length (P = 0718) of endogenous nuclear DNA, sequence GC content (P = 0.311), double-stranded DNA damage rate (v. 0.309), and sequence clonality (P = 0.093). Small significant differences were found in single-strand DNA damage rate (δS; slightly lower for the BGISEQ-500, P = 0.011) and the background rate of difference from the reference genome (θ; slightly higher for BGISEQ-500, P = 0.012). This may result from the differences in amplification cycles used to polymerase chain reaction–amplify the libraries. A significant difference was also observed in the mitochondrial DNA percentages recovered (P = 0.018), although we believe this is likely a stochastic effect relating to the extremely low levels of mitochondria that were sequenced from 3 of the samples with overall very low levels of endogenous DNA. Although we acknowledge that our analyses were limited to animal material, our observations suggest that the BGISEQ-500 holds the potential to represent a valid and potentially valuable alternative platform for palaeogenomic data generation that is worthy of future exploration by those interested in the sequencing and analysis of degraded DNA.

Abstract In recent years, massive parallel sequencing has revolutionised the study of degraded DNA , thus enabling the field of ancient DNA to evolve into that of paleogenomics. Despite these advances, the recovery and sequencing of degraded DNA remains challenging due to limitations in the manipulation of chemically damaged and highly fragmented DNA molecules. In particular, the enzymatic reactions and DNA purification steps during library preparation can result in DNA template loss and sequencing biases, affecting downstream analyses. The development of library preparation methods that circumvent these obstacles and enable higher throughput are therefore of interest to researchers working with degraded DNA . In this study, we compare four Illumina library preparation protocols, including two “single‐tube” methods developed for this study with the explicit aim of improving data quality and reducing preparation time and expenses. The methods are tested on grey wolf ( Canis lupus ) museum specimens. We found single‐tube protocols increase library complexity, yield more reads that map uniquely to the reference genome, reduce processing time, and may decrease laboratory costs by 90%. Given the advantages of single‐tube library preparations, we anticipate these methods will be of considerable interest to the growing field of paleogenomics and other applications investigating degraded DNA .

The grey wolf (Canis lupus) was the first species to give rise to a domestic population, and they remained widespread throughout the last Ice Age when many other large mammal species went extinct. Little is known, however, about the history and possible extinction of past wolf populations or when and where the wolf progenitors of the present-day dog lineage (Canis familiaris) lived1-8. Here we analysed 72 ancient wolf genomes spanning the last 100,000 years from Europe, Siberia and North America. We found that wolf populations were highly connected throughout the Late Pleistocene, with levels of differentiation an order of magnitude lower than they are today. This population connectivity allowed us to detect natural selection across the time series, including rapid fixation of mutations in the gene IFT88 40,000-30,000 years ago. We show that dogs are overall more closely related to ancient wolves from eastern Eurasia than to those from western Eurasia, suggesting a domestication process in the east. However, we also found that dogs in the Near East and Africa derive up to half of their ancestry from a distinct population related to modern southwest Eurasian wolves, reflecting either an independent domestication process or admixture from local wolves. None of the analysed ancient wolf genomes is a direct match for either of these dog ancestries, meaning that the exact progenitor populations remain to be located.

ABSTRACT Ancient DNA (aDNA) sequencing has enabled unprecedented reconstruction of speciation, migration, and admixture events for extinct taxa 1 . Outside the permafrost, however, irreversible aDNA post-mortem degradation 2 has so far limited aDNA recovery within the ˜0.5 million years (Ma) time range 3 . Tandem mass spectrometry (MS)-based collagen type I (COL1) sequencing provides direct access to older biomolecular information 4 , though with limited phylogenetic use. In the absence of molecular evidence, the speciation of several Early and Middle Pleistocene extinct species remain contentious. In this study, we address the phylogenetic relationships of the Eurasian Pleistocene Rhinocerotidae 5-7 using ˜1.77 million years (Ma) old dental enamel proteome sequences of a Stephanorhinus specimen from the Dmanisi archaeological site in Georgia (South Caucasus) 8 . Molecular phylogenetic analyses place the Dmanisi Stephanorhinus as a sister group to the woolly ( Coelodonta antiquitatis ) and Merck’s rhinoceros ( S. kirchbergensis ) clade. We show that Coelodonta evolved from an early Stephanorhinus lineage and that this genus includes at least two distinct evolutionary lines. As such, the genus Stephanorhinus is currently paraphyletic and its systematic revision is therefore needed. We demonstrate that Early Pleistocene dental enamel proteome sequencing overcomes the limits of ancient collagen- and aDNA-based phylogenetic inference, and also provides additional information about the sex and taxonomic assignment of the specimens analysed. Dental enamel, the hardest tissue in vertebrates, is highly abundant in the fossil record. Our findings reveal that palaeoproteomic investigation of this material can push biomolecular investigation further back into the Early Pleistocene.

Summary The Sicilian wolf represented the only population of wolves living on a Mediterranean island until the first half of the twentieth century (1930s-1960s) 1–7 . Previous studies hypothesised that they remained isolated from mainland wolves from the end of the Last Glacial Maximum (LGM) 8,9 , until human persecutions led them to extinction 1–7 . There are only seven known Sicilian wolf specimens from the 19th and 20th century preserved in museums in Italy and recent morphometric analyses assigned them to the new subspecies Canis lupus cristaldii 10 . To better understand the origins of the Sicilian wolf, and its relationship to other wolf populations, we sequenced four whole genomes (3.8×-11.6×) and five mitogenomes. We investigated the relationship between Sicilian wolves and other modern breeds to identify potential admixture. Furthermore, considering that the last land-bridge between Sicily and Italy disappeared after the LGM 11 , around 17 kya, we explored the possibility that the Sicilian wolf retained ancestry from ancient wolf and dog lineages. Additionally, we explored whether the long-term isolation might have affected the genomic diversity, inbreeding levels and genetic load of the Sicilian wolf. Our findings show that the Sicilian wolves shared most ancestry with the modern Italian wolf population but are better modelled as admixed with European dog breeds, and shared traces of Eneolithic and Bronze age European dogs. We also find signatures of severe inbreeding and low genomic diversity at population and individual levels due to long-term isolation and drift, suggesting also low effective population size.

Abstract Understanding the rate and pattern of germline mutations is of fundamental importance for understanding evolutionary processes. Here we analyzed 19 parent-offspring trios of rhesus macaques ( Macaca mulatta ) at high sequencing coverage of ca. 76X per individual, and estimated an average rate of 0.77 × 10 −8 de novo mutations per site per generation (95 % CI: 0.69 × 10 −8 - 0.85 × 10 −8 ). By phasing 50 % of the mutations to parental origins, we found that the mutation rate is positively correlated with the paternal age. The paternal lineage contributed an average of 81 % of the de novo mutations, with a trend of an increasing male contribution for older fathers. About 3.5 % of de novo mutations were shared between siblings, with no parental bias, suggesting that they arose from early development (postzygotic) stages. Finally, the divergence times between closely related primates calculated based on the yearly mutation rate of rhesus macaque generally reconcile with divergence estimated with molecular clock methods, except for the Cercopithecidae/Hominoidea molecular divergence dated at 52 Mya using our new estimate of the yearly mutation rate.

While sequencing ancient DNA from archaeological material is now commonplace, very few attempts to sequence ancient transcriptomes have been made, even from typically stable deposition environments such as permafrost. This is presumably due to assumptions that RNA completely degrades relatively quickly, particularly when dealing with autolytic, nuclease-rich mammalian tissues. However, given the recent successes in sequencing ancient RNA (aRNA) from various sources including plants and animals, we suspect that these assumptions may be incorrect or exaggerated. To challenge the underlying dogma, we generated shotgun RNA data from sources that might normally be dismissed for such study. Here we present aRNA data generated from two historical wolf skins, and permafrost-preserved liver tissue of a 14,300-year-old Pleistocene canid. Not only is the latter the oldest RNA ever to be sequenced, but also shows evidence of biologically relevant tissue-specificity and close similarity to equivalent data derived from modern-day control tissue. Other hallmarks of RNA-seq data such as exon-exon junction presence and high endogenous ribosomal RNA content confirms our data's authenticity. By performing independent technical replicates using two high-throughput sequencing platforms, we show not only that aRNA can survive for extended periods in mammalian tissues, but also that it has potential for tissue identification, and possibly further uses such as in vivo genome activity and adaptation, when sequenced using this technology.

We present a complete ancient human genome and oral microbiome sequenced from a piece of resinous "chewing gum" recovered from a Stone Age site on the island of Lolland, Denmark, and directly dated to 5,858-5,661 cal. BP (GrM-13305; 5,007+/-11). We sequenced the genome to an average depth-of-coverage of 2.3x and find that the individual who chewed the resin was female and genetically more closely related to western hunter-gatherers from mainland Europe, than hunter-gatherers from central Scandinavia. We use imputed genotypes to predict physical characteristics and find that she had dark skin and hair, and blue eyes. Lastly, we also recovered microbial DNA that is characteristic of an oral microbiome and faunal reads that likely associate with diet. The results highlight the potential for this type of sample material as a new source of ancient human and microbial DNA.

Abstract Several African mammals exhibit a phylogeographic pattern where closely related taxa are split between West/Central and East/Southern Africa, but their evolutionary relationships and histories remain controversial. Bushpigs ( Potamochoerus larvatus ) and red river hogs ( P. porcus ) are recognised as separate species due to morphological distinctions, a perceived lack of interbreeding at contact, and putatively old divergence times, but historically, they were considered conspecific. Moreover, the presence of Malagasy bushpigs as the sole large terrestrial mammal shared with the African mainland raises intriguing questions about its origin and arrival in Madagascar. Analyses of 67 whole genomes revealed a genetic continuum between the two species, with putative signatures of historical gene flow, variable F ST values, and a recent divergence time (<500,000 years). Thus, our study challenges key arguments for splitting Potamochoerus into two species and suggests their speciation might be incomplete. Our findings also indicate that Malagasy bushpigs diverged from southern African populations and underwent a limited bottleneck 1,000-5,000 years ago, concurrent with human arrival in Madagascar. These results shed new light on the evolutionary history of an iconic and widespread African genus and provide insight into the longstanding biogeographic puzzle surrounding the bushpig’s presence in Madagascar.