Association analysis identifies 65 new breast cancer risk loci, predicts target genes for known risk loci and demonstrates a strong overlap with somatic driver genes in breast tumours. Genome-wide association studies for breast cancer have identified common genetic variation that influences susceptibility to this disease, but much of the genetic risk remains unexplained. Doug Easton and colleagues report a genome-wide association study for breast cancer in more than 122,000 cases and 105,000 controls. The authors genotyped a subset of these cases using OncoArray, a new, custom genome-wide single-nucleotide polymorphism (SNP) array for cancer genomics. Overall, they identify 65 loci newly associated with breast cancer susceptibility, and estimate that, together with 107 previously identified breast cancer susceptibility loci, these explain about 18 per cent of the familial relative risk of breast cancer. Polygenic risk scores may be used in risk prediction models and may improve early detection and targeted prevention of the disease. Breast cancer risk is influenced by rare coding variants in susceptibility genes, such as BRCA1, and many common, mostly non-coding variants. However, much of the genetic contribution to breast cancer risk remains unknown. Here we report the results of a genome-wide association study of breast cancer in 122,977 cases and 105,974 controls of European ancestry and 14,068 cases and 13,104 controls of East Asian ancestry1. We identified 65 new loci that are associated with overall breast cancer risk at P < 5 × 10−8. The majority of credible risk single-nucleotide polymorphisms in these loci fall in distal regulatory elements, and by integrating in silico data to predict target genes in breast cells at each locus, we demonstrate a strong overlap between candidate target genes and somatic driver genes in breast tumours. We also find that heritability of breast cancer due to all single-nucleotide polymorphisms in regulatory features was 2–5-fold enriched relative to the genome-wide average, with strong enrichment for particular transcription factor binding sites. These results provide further insight into genetic susceptibility to breast cancer and will improve the use of genetic risk scores for individualized screening and prevention.

Stig Bojesen, Georgia Chenevix-Trench, Alison Dunning and colleagues report common variants at the TERT-CLPTM1L locus associated with mean telomere length measured in whole blood. They also identify associations at this locus to breast or ovarian cancer susceptibility and report functional studies in breast and ovarian cancer tissue and cell lines. TERT-locus SNPs and leukocyte telomere measures are reportedly associated with risks of multiple cancers. Using the Illumina custom genotyping array iCOGs, we analyzed ∼480 SNPs at the TERT locus in breast (n = 103,991), ovarian (n = 39,774) and BRCA1 mutation carrier (n = 11,705) cancer cases and controls. Leukocyte telomere measurements were also available for 53,724 participants. Most associations cluster into three independent peaks. The minor allele at the peak 1 SNP rs2736108 associates with longer telomeres (P = 5.8 × 10−7), lower risks for estrogen receptor (ER)-negative (P = 1.0 × 10−8) and BRCA1 mutation carrier (P = 1.1 × 10−5) breast cancers and altered promoter assay signal. The minor allele at the peak 2 SNP rs7705526 associates with longer telomeres (P = 2.3 × 10−14), higher risk of low-malignant-potential ovarian cancer (P = 1.3 × 10−15) and greater promoter activity. The minor alleles at the peak 3 SNPs rs10069690 and rs2242652 increase ER-negative (P = 1.2 × 10−12) and BRCA1 mutation carrier (P = 1.6 × 10−14) breast and invasive ovarian (P = 1.3 × 10−11) cancer risks but not via altered telomere length. The cancer risk alleles of rs2242652 and rs10069690, respectively, increase silencing and generate a truncated TERT splice variant.

Long noncoding RNAs (lncRNAs) are increasingly recognized to play major regulatory roles in development and disease. To identify novel regulators in breast biology, we identified differentially regulated lncRNAs during mouse mammary development. Among the highest and most differentially expressed was a transcript ( Zfas1 ) antisense to the 5′ end of the protein-coding gene Znfx1 . In vivo, Zfas1 RNA is localized within the ducts and alveoli of the mammary gland. Zfas1 intronically hosts three previously undescribed C/D box snoRNAs (SNORDs): Snord12 , Snord12b , and Snord12c . In contrast to the general assumption that noncoding SNORD-host transcripts function only as vehicles to generate snoRNAs, knockdown of Zfas1 in a mammary epithelial cell line resulted in increased cellular proliferation and differentiation, while not substantially altering the levels of the SNORDs. In support of an independent function, we also found that Zfas1 is extremely stable, with a half-life >16 h. Expression analysis of the SNORDs revealed these were expressed at different levels, likely a result of distinct structures conferring differential stability. While there is relatively low primary sequence conservation between Zfas1 and its syntenic human ortholog ZFAS1 , their predicted secondary structures have similar features. Like Zfas1 , ZFAS1 is highly expressed in the mammary gland and is down-regulated in breast tumors compared to normal tissue. We propose a functional role for Zfas1/ ZFAS1 in the regulation of alveolar development and epithelial cell differentiation in the mammary gland, which, together with its dysregulation in human breast cancer, suggests ZFAS1 as a putative tumor suppressor gene.

// Juliet D. French 1,* , Sharon E. Johnatty 1,* , Yi Lu 1,* , Jonathan Beesley 1 , Bo Gao 2 , Murugan Kalimutho 1 , Michelle J. Henderson 3 , Amanda J. Russell 3 , Siddhartha Kar 4 , Xiaoqing Chen 1 , Kristine M. Hillman 1 , Susanne Kaufmann 1 , Haran Sivakumaran 1 , Martin O'Reilly 5 , Chen Wang 6 , Darren J. Korbie 7 , Australian Ovarian Cancer Study Group 1,2,8 , Australian Cancer Study 1 , Diether Lambrechts 9,10 , Evelyn Despierre 10 , Els Van Nieuwenhuysen 10 , Sandrina Lambrechts 10 , Ignace Vergote 10 , Beth Karlan 11 , Jenny Lester 11 , Sandra Orsulic 11 , Christine Walsh 11 , Peter A. Fasching 12,13 , Matthias W. Beckmann 12 , Arif B. Ekici 42 , Alexander Hein 12 , Keitaro Matsuo 14 , Satoyo Hosono 14 , Jacobus Pisterer 15 , Peter Hillemanns 16 , Toru Nakanishi 17 , Yasushi Yatabe 18 , Marc T. Goodman 19 , Galina Lurie 20 , Rayna K. Matsuno 20 , Pamela J. Thompson 19 , Tanja Pejovic 21 , Yukie Bean 21 , Florian Heitz 22,23 , Philipp Harter 22,23 , Andreas du Bois 22,23 , Ira Schwaab 24 , Estrid Hogdall 25,26 , Susanne K. Kjaer 25,27 , Allan Jensen 25 , Claus Hogdall 27 , Lene Lundvall 27 , Svend Aage Engelholm 28 , Bob Brown 29 , James M. Flanagan 29 , Michelle D. Metcalf 29 , Nadeem Siddiqui 30 , Thomas Sellers 31 , Brooke Fridley 32 , Julie Cunningham 33 , Joellen M. Schildkraut 34,35 , Ed Iversen 36 , Rachel Palmieri Weber 34 , Donal Brennan 37 , Andrew Berchuck 38 , Paul Pharoah 4,39 , Paul Harnett 40 , Murray D. Norris 3 , Michelle Haber 3 , Ellen L. Goode 41 , Jason S. Lee 1 , Kum Kum Khanna 1 , Kerstin B. Meyer 5 , Georgia Chenevix-Trench 1,*,** , Anna deFazio 2,*,** , Stacey L. Edwards 1,*,** , Stuart MacGregor 1,*,** and on behalf of the Ovarian Cancer Association Consortium 1 QIMR Berghofer Medical Research Institute, Brisbane, Australia 2 Department of Gynaecological Oncology and Centre for Cancer Research, The Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, Westmead Hospital, Sydney, Australia 3 Children's Cancer Institute Australia, Randwick, Australia 4 Centre for Cancer Genetic Epidemiology, Department of Public Health and Primary Care, University of Cambridge, Cambridge, UK 5 Cancer Research UK Cambridge Research Institute, Li Ka Shing Centre, Cambridge, UK 6 Department of Health Sciences Research, Division of Biomedical Statistics and Informatics, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA 7 Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, Brisbane, Australia 8 Peter MacCallum Cancer Centre, Melbourne, Australia 9 Vesalius Research Center, VIB, Leuven, Belgium and Laboratory for Translational Genetics, Department of Oncology, University of Leuven, Leuven, Belgium 10 Gynecologic Oncology, Leuven Cancer Institute, University Hospitals Leuven, Leuven, Belgium 11 Women's Cancer Program at the Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, USA 12 Department of Gynecology and Obstetrics, University Hospital Erlangen, Friedrich-Alexander University Erlangen- Nuremberg, Comprehensive Cancer Center Erlangen-Nuremberg, Erlangen, Germany 13 Department of Medicine, Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, CA, USA 14 Division of Epidemiology and Prevention, Aichi Cancer Center Research Institute, Nagoya, Aichi, Japan 15 Zentrum für Gynäkologische Onkologie, Kiel, Germany 16 Departments of Obstetrics and Gynaecology, Hannover Medical School, Hannover, Germany 17 Department of Gynecology, Aichi Cancer Center Central Hospital, Nagoya, Aichi, Japan 18 Department of Pathology and Molecular Diagnostics, Aichi Cancer Center Central Hospital, Nagoya, Aichi, Japan 19 Cancer Prevention and Control Program, Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA, USA 20 Cancer Epidemiology Program, University of Hawaii Cancer Center, Hawaii, USA 21 Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University and Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University, Portland, OR, USA 22 Department of Gynecology and Gynecologic Oncology, Dr. Horst Schmidt Kliniken Wiesbaden, Wiesbaden, Germany 23 Department of Gynecology and Gynecologic Oncology, Kliniken Essen-Mitte, Essen, Germany 24 Institut für Humangenetik Wiesbaden, Germany 25 Danish Cancer Society Research Center, Unit of Virus, Lifestyle and Genes, Copenhagen, Denmark 26 Molecular Unit, Department of Pathology, Herlev Hospital, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark 27 Department of Gynecology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, Denmark 28 Department of Oncology, Rigshospitalet, University of Copenhagen, Denmark 29 Department of Surgery and Cancer, Imperial College London, London, UK 30 North Glasgow University Hospitals NHS Trust, Stobhill Hospital, Glasgow, UK 31 Department of Cancer Epidemiology, Moffitt Cancer Center, Tampa, FL, USA 32 Department of Biostatistics, University of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, USA 33 Department of Laboratory Medicine and Pathology, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA 34 Department of Community and Family Medicine, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA 35 Cancer Control and Population Sciences, Duke Cancer Institute, Durham, NC, USA 36 Department of Statistical Science, Duke University, Durham, NC, USA 37 Queensland Centre for Gynaecological Cancer, Brisbane, Australia 38 Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center, Durham, NC, USA 39 Centre for Cancer Genetic Epidemiology, Department of Oncology, University of Cambridge, Cambridge, UK 40 Crown Princess Mary Cancer Centre and Centre for Cancer Research, The Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, Westmead Hospital, Sydney, Australia 41 Department of Health Science Research, Division of Epidemiology, Mayo Clinic, Rochester, MN, USA 42 Institute of Human Genetics, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen, Germany * These authors contributed equally to the study and are listed alphabetically ** These authors co-directed the study and are listed alphabetically Correspondence to: Georgia Chenevix-Trench, email: // Anna deFazio, email: // Stacey L. Edwards, email: // Stuart MacGregor, email: // Keywords : epithelial ovarian cancer, progression free survival, genome-wide association study, PSIP1, chromosome conformation capture Received : January 14, 2016 Accepted : January 21, 2016 Published : January 31, 2016 Abstract Women with epithelial ovarian cancer (EOC) are usually treated with platinum/taxane therapy after cytoreductive surgery but there is considerable inter-individual variation in response. To identify germline single-nucleotide polymorphisms (SNPs) that contribute to variations in individual responses to chemotherapy, we carried out a multi-phase genome-wide association study (GWAS) in 1,244 women diagnosed with serous EOC who were treated with the same first-line chemotherapy, carboplatin and paclitaxel. We identified two SNPs (rs7874043 and rs72700653) in TTC39B (best P=7x10 -5 , HR=1.90, for rs7874043) associated with progression-free survival (PFS). Functional analyses show that both SNPs lie in a putative regulatory element (PRE) that physically interacts with the promoters of PSIP1 , CCDC171 and an alternative promoter of TTC39B. The C allele of rs7874043 is associated with poor PFS and showed increased binding of the Sp1 transcription factor, which is critical for chromatin interactions with PSIP1 . Silencing of PSIP1 significantly impaired DNA damage-induced Rad51 nuclear foci and reduced cell viability in ovarian cancer lines. PSIP1 (PC4 and SFRS1 Interacting Protein 1) is known to protect cells from stress-induced apoptosis, and high expression is associated with poor PFS in EOC patients. We therefore suggest that the minor allele of rs7874043 confers poor PFS by increasing PSIP1 expression.

ABSTRACT Genome-wide association studies have identified breast cancer risk variants in over 150 genomic regions, but the mechanisms underlying risk remain largely unknown. These regions were explored by combining association analysis with in silico genomic feature annotations. We defined 205 independent risk-associated signals with the set of credible causal variants (CCVs) in each one. In parallel, we used a Bayesian approach (PAINTOR) that combines genetic association, linkage disequilibrium, and enriched genomic features to determine variants with high posterior probabilities (HPPs) of being causal. Potentially causal variants were significantly over-represented in active gene regulatory regions and transcription factor binding sites. We applied our INQUSIT pipeline for prioritizing genes as targets of potentially causal variants, using gene expression (eQTL), chromatin interaction and functional annotations. Known cancer drivers, transcription factors and genes in the developmental, apoptosis, immune system and DNA integrity checkpoint gene ontology pathways, were over-represented among the 178 highest confidence target genes.

Abstract CRISPR/Cas9-mediated genome editing shows cogent potential for the genetic modification of helminth parasites. Here we report successful gene knock-in (KI) into the genome of the egg of Schistosoma mansoni by combining CRISPR/Cas9 with single-stranded oligodeoxynucleotides (ssODNs). We edited the acetylcholinesterase (AChE) gene of S. mansoni targeting two guide RNAs (gRNAs), X5 and X7, located on exon 5 and exon 7 of Smp_154600, respectively. A CRISPR/Cas9-vector encoding gRNA X5 or X7 was introduced by electroporation into eggs recovered from livers of experimentally infected mice. Simultaneously, eggs were transfected with a ssODN donor encoding a stop codon in all six frames, flanked by 50 nt-long 5’- and 3’-homology arms matching the predicted Cas9-catalyzed double stranded break at X5 or X7. Next generation sequencing analysis of reads of amplicon libraries spanning targeted regions revealed that the major modifications induced by CRISPR/Cas9 in the eggs were generated by homology directed repair (HDR). Furthermore, soluble egg antigen from AChE-edited eggs exhibited markedly reduced AChE activity, indicative that programmed Cas9 cleavage mutated the AChE gene. Following injection of AChE-edited schistosome eggs into the tail veins of mice, a significant decrease in circumoval granuloma size was observed in the lungs of the mice. Notably, there was an enhanced Th2 response involving IL-4, −5, −10, and-13 induced by lung cells and splenocytes in mice injected with X5-KI eggs in comparison to control mice injected with unmutated eggs. A Th2-predominant response, with increased levels of IL-4, −13 and GATA3, also was induced by X5 KI eggs in small intestine-draining mesenteric lymph node cells when the gene-edited eggs were introduced into the subserosa of the ileum of the mice. These findings confirmed the potential and the utility of CRISPR/Cas9-mediated genome editing for functional genomics in schistosomes. Author Summary Schistosomiasis is the most devastating of the parasitic helminth diseases. Currently, no vaccines are available for human use and praziquantel is the only available treatment raising considerable concern that drug resistance will develop. A major challenge faced by the schistosomiasis research community is the lack of suitable tools to effectively characterise schistosome gene products as potential new drug and/or vaccine targets. We introduced CRISPR/Cas9 mediated editing into S. mansoni eggs targeting the gene encoding acetylcholinesterase (AChE), a recognized anthelminthic drug target. We found that the major modifications induced by CRISPR/Cas9 in the eggs were generated by homology directed repair (HDR). This platform provides a unique opportunity to generate precise loss-of-function insertions into the schistosome genome. We pre-screened the activity of two guide RNAs of the AChE gene and compared/validated the mutation efficacy using next-generation sequencing analysis at the genomic level and phenotypic modifications at the protein level. That resulted in reduced AChE activity observed in AChE-edited eggs, and decreased lung circumoval granuloma size in mice injected with those edited eggs. The CRISPR/Cas9-genome editing system we established in this study provides a pivotal platform for gene functional studies to identify and test new anti-schistosome intervention targets, which can be extended to the other human schistosome species and other important parasitic helminths.

ABSTRACT Single-cell RNAseq has allowed unprecedented insight into gene expression across different cell populations in normal tissue and disease states. However, almost all studies rely on annotated gene sets to capture gene expression levels and sequencing reads that do not align to known genes are discarded. Here, we discover thousands of long noncoding RNAs (lncRNAs) expressed in human mammary epithelial cells and analyze their expression in individual cells of the normal breast. We show that lncRNA expression alone can discriminate between luminal and basal cell types and define subpopulations of both compartments. Clustering cells based on lncRNA expression identified additional basal subpopulations, compared to clustering based on annotated gene expression, suggesting that lncRNAs can provide an additional layer of information to better distinguish breast cell subpopulations. In contrast, these breast-specific lncRNAs poorly distinguish brain cell populations, highlighting the need to annotate tissue-specific lncRNAs prior to expression analyses. We also identified a panel of 100 breast lncRNAs that could discern breast cancer subtypes better than protein-coding markers. Overall, our results suggest that lncRNAs are an unexplored resource for new biomarker and therapeutic target discovery in the normal breast and breast cancer subtypes.

Abstract Employing the flatworm parasite Schistosoma mansoni as a model, we report the first application of CRISPR interference (CRISPRi) in parasitic helminths for loss-of-function targeting the SmfgfrA gene which encodes the stem cell marker, fibroblast growth factor receptor A. SmFGFRA is essential for maintaining schistosome stem cells and critical in the schistosome-host interplay. The SmfgfrA gene was targeted in S. mansoni adult worms, eggs and schistosomula using a catalytically dead Cas9 (dCas9) fused to a transcriptional repressor KRAB. We showed that SmfgfrA repression resulted in considerable phenotypic differences in the modulated parasites compared with controls, including reduced levels of SmfgfrA transcription and decreased protein expression of SmFGFRA, a decline in EdU (thymidine analog 5-ethynyl-2’-deoxyuridine, which specifically stains schistosome stem cells) signal, and an increase in cell apoptosis. Notably, reduced SmfgfrA transcription was evident in miracidia hatched from SmfgfrA -repressed eggs, and resulted in a significant change in miracidial behavior, indicative of a durable repression effect caused by CRISPRi. Intravenous injection of mice with SmfgfrA -repressed eggs resulted in granulomas that were markedly reduced in size and a decline in the level of serum IgE, emphasizing the importance of SmFGFRA in regulating the host immune response induced during schistosome infection. Our findings show the feasibility of applying CRISPRi for effective, targeted transcriptional repression in schistosomes, and provide the basis for employing CRISPRi to selectively perturb gene expression in parasitic helminths on a genome-wide scale.