Abstract Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD), the most common human prion disease, is thought to occur when the cellular prion protein (PrP C ) spontaneously misfolds and assembles into prion fibrils, culminating in fatal neurodegeneration. In a genome-wide association study of sCJD, we recently identified risk variants in and around the gene STX6 , with evidence to suggest a causal increase of STX6 expression in disease-relevant brain regions. STX6 encodes syntaxin-6, a SNARE protein primarily involved in early endosome to trans -Golgi network retrograde transport. Here we developed and characterised a mouse model with genetic depletion of Stx6 and investigated a causal role of Stx6 expression in mouse prion disease through a classical prion transmission study, assessing the impact of homozygous and heterozygous syntaxin-6 knockout on disease incubation periods and prion-related neuropathology. Following inoculation with RML prions, incubation periods in Stx6 -/- and Stx6 +/- mice differed by 12 days relative to wildtype. Similarly, in Stx6 -/- mice, disease incubation periods following inoculation with ME7 prions also differed by 12 days. Histopathological analysis revealed a modest increase in astrogliosis in ME7-inoculated Stx6 -/- animals and a variable effect of Stx6 expression on microglia activation, however no differences in neuronal loss, spongiform change or PrP deposition were observed at endpoint. Importantly, Stx6 -/- mice are viable and fertile with no gross impairments on a range of neurological, biochemical, histological and skeletal structure tests. Our results provide some support for a pathological role of Stx6 expression in prion disease, which warrants further investigation in the context of prion disease but also other neurodegenerative diseases considering syntaxin-6 appears to have pleiotropic risk effects in progressive supranuclear palsy and Alzheimer’s disease. Author Summary Sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD), the most common human prion disease, is an invariably fatal disease with no established disease-modifying treatments. The identification of STX6 as a proposed risk gene for sCJD motivated the generation of a new mouse knockout model, in which we found no grossly deleterious phenotypes. A transmission study in Stx6 -/- , Stx6 +/- and Stx6 +/+ mice challenged with two prion strains showed reduced syntaxin-6 expression is associated with a modest prolongation of prion disease incubation periods, supporting a pathological role of Stx6 expression in prion disease pathogenesis. Syntaxin-6 appears to have pleiotropic risk effects across multiple neurodegenerative diseases including progressive supranuclear palsy and Alzheimer’s disease. Thus, this work supports further exploration of the STX6 susceptibility mechanism, which likely has relevance across multiple neurodegenerative diseases.

Recent developments in CRISPR/Cas9 genome editing tools have facilitated the introduction of more complex alleles, often spanning genetic intervals of several kilobases, directly into the embryo. These techniques often produce mosaic founder animals and the introduction of donor templates, via homologous directed repair, can be erroneous or incomplete. Newly generated alleles must be verified at the sequence level across the targeted locus. Screening for the presence of the desired mutant allele using traditional sequencing methods can be challenging due to the size of the desired edit(s) together with founder mosaicism. In order to help disentangle the genetic complexity of these animals, we tested the application of Oxford Nanopore long read sequencing of the targeted locus. Taking advantage of sequencing the entire length of the segment in each single read, we were able to determine whether the entire intended mutant sequence was present in both mosaic founders and their offspring.

Highlights•Hyperactivity associated with moderate hearing loss in ENU-induced whirlin mutant•Overexpression of C-terminus whirlin in the brain rescues hyperactive behaviors•Transcriptional profile of whirlin across tissues underscores pleiotropy•Qualitative deficit in the temporal processing of the acoustic stimulusSummaryDespite some evidence indicating diverse roles of whirlin in neurons, the functional corollary of whirlin gene function and behavior has not been investigated or broadly characterized. A single nucleotide variant was identified from our recessive ENU-mutagenesis screen at a donor-splice site in whirlin, a protein critical for proper sensorineural hearing function. The mutation (head-bob, hb) led to partial intron-retention causing a frameshift and introducing a premature termination codon. Mutant mice had a head-bobbing phenotype and significant hyperactivity across several phenotyping tests. Lack of complementation of head-bob with whirler mutant mice confirmed the head-bob mutation as functionally distinct with compound mutants having a mild-moderate hearing defect. Utilizing transgenics, we demonstrate rescue of the hyperactive phenotype and combined with the expression profiling data conclude whirlin plays an essential role in activity-related behaviors. These results highlight a pleiotropic role of whirlin within the brain and implicate alternative, central mediated pathways in its function.Graphical abstract

Dislocation in hindlimb tarsals are being observed at a low, but persistent frequency in adult male mice from C57BL/6N substrains. Clinical signs included a sudden onset of mild to severe unilateral or bilateral tarsal abduction, swelling, abnormal hindlimb morphology and lameness. Contraction of digits and gait abnormalities were noted in multiple cases. Radiographical and histological examination revealed caudal dislocation of the calcaneus and partial dislocation of the calcaneoquartal (calcaneous-tarsal bone IV) joint. The detection, frequency, and cause of this pathology in five large mouse production and phenotyping centres (MRC Harwell, UK; The Jackson Laboratory, USA; The Centre for Phenogenomics, Canada; German Mouse Clinic, Germany; Baylor College of Medicine, USA) are discussed.