Wolbachia are intracellular bacterial symbionts that are able to protect various insect hosts from viral infections. This tripartite interaction was initially described in Drosophila melanogaster carrying wMel, its natural Wolbachia strain. wMel has been shown to be genetically polymorphic and there has been a recent change in variant frequencies in natural populations. We have compared the antiviral protection conferred by different wMel variants, their titres and influence on host longevity, in a genetically identical D. melanogaster host. The phenotypes cluster the variants into two groups — wMelCS-like and wMel-like. wMelCS-like variants give stronger protection against Drosophila C virus and Flock House virus, reach higher titres and often shorten the host lifespan. We have sequenced and assembled the genomes of these Wolbachia, and shown that the two phenotypic groups are two monophyletic groups. We have also analysed a virulent and over-replicating variant, wMelPop, which protects D. melanogaster even better than the closely related wMelCS. We have found that a ∼21 kb region of the genome, encoding eight genes, is amplified seven times in wMelPop and may be the cause of its phenotypes. Our results indicate that the more protective wMelCS-like variants, which sometimes have a cost, were replaced by the less protective but more benign wMel-like variants. This has resulted in a recent reduction in virus resistance in D. melanogaster in natural populations worldwide. Our work helps to understand the natural variation in wMel and its evolutionary dynamics, and inform the use of Wolbachia in arthropod-borne disease control.

Abstract Wolbachia is a maternally transmitted bacterium widespread in arthropods and filarial nematodes, and confers strong antiviral protection in Drosophila melanogaster and other insects. Wolbachia -transinfected Aedes aegypti are currently being deployed to fight transmission of dengue and Zika viruses. However, the mechanism of antiviral protection and factors influencing it are still not fully understood. Here we show that temperature modulates Wolbachia -conferred protection in Drosophila melanogaster . Temperature after infection directly impacts Drosophila C virus replication and modulates Wolbachia protection. At higher temperatures virus proliferates more and is more lethal, while Wolbachia confers lower protection. Strikingly, host developmental temperature is a determinant of Wolbachia -conferred antiviral protection. While there is a strong protection when flies are raised from egg to adult at 25°C, the protection is highly reduced or completely abolished when flies develop at 18°C. However, Wolbachia -induced changes during development are not sufficient to limit virus-induced mortality, as Wolbachia is still required to be present in adults at the time of infection. This developmental effect is general, since it was present in different host genotypes, Wolbachia variants and upon infection with different viruses. Overall, we show that Wolbachia -conferred antiviral protection is temperature dependent, being present or absent depending on the environmental conditions. This interaction likely impacts Wolbachia -host interactions in nature and, as a result, frequencies of host and symbionts in different climates. Dependence of Wolbachia -mediated pathogen blocking on developmental temperature could be used to dissect the mechanistic bases of protection and should be considered by programmes deploying Wolbachia as an antiviral agent in the field. Significance Statement Insects are often infected with beneficial intracellular bacteria. The bacterium Wolbachia can protect insects from pathogenic viruses. This effect can be used to prevent transmission of dengue and Zika viruses by Wolbachia -infected mosquitoes. To deploy Wolbachia in the field successfully and understand the biology of insects in the wild we need to discover which factors affect Wolbachia -conferred antiviral protection. Here we show that the temperature in which insects develop from eggs to adults can determine presence or absence of antiviral protection. The environment, therefore, influences this insect-bacterium interaction. Our work may help to provide insights into the mechanism of viral blocking by Wolbachia and inform programs using Wolbachia in mosquito-borne disease control.

Abstract The outcome of natural enemy attack in insects has commonly been found to be influenced by the presence of protective symbionts in the host. The degree to which protection functions in natural populations, however, will depend on the robustness of the phenotype to variation in the abiotic environment. We studied the impact of a key environmental parameter – temperature – on the efficacy of the protective effect of the symbiont Spiroplasma on its host Drosophila hydei , against attack by the parasitoid wasp Leptopilina heterotoma . In addition, we investigated the thermal sensitivity of the symbiont’s vertical transmission, which may be a key determinant of the ability of the symbiont to persist. We found that vertical transmission was more robust than previously considered, with Spiroplasma being maintained at 25 °C, 18 °C and with 18/15 °C diurnal cycles, with rates of segregational loss only increasing at 15 °C. Protection against wasp attack was ablated before symbiont transmission was lost, with the symbiont failing to rescue the fly host at 18 °C. We conclude that the presence of a protective symbiosis in natural populations cannot be simply inferred from presence of a symbiont whose protective capacity has been tested under narrow controlled conditions. More broadly, we argue that the thermal environment is likely to represent an important determinant of the evolutionary ecology of defensive symbioses in natural environments, potentially driving seasonal, latitudinal and altitudinal variation in symbiont frequency, and modulating the strength of selection for symbiotic protective systems compared to defensive systems encoded in the nuclear genomes.

ABSTRACT The genus Arsenophonus has been traditionally considered to be comprised of heritable bacterial symbionts of arthropods. Recent work has reported a microbe related to the type species A. nasoniae as infecting the honey bee, Apis mellifera . The association was unusual for members of the genus in that the microbe-host interaction arose through environmental and social exposure rather than vertical transmission. In this study, we describe the in vitro culture of ArsBeeUS, a strain of this microbe isolated from A. mellifera in the USA. The 16S rRNA sequence of the isolated strain clearly indicates it falls within the genus Arsenophonus . Biolog analysis indicates the bacterium has a restricted range of nutrients that support growth. In vivo experiments demonstrate the strain proliferates rapidly on injection into A. mellifera hosts. We further report the closed genome sequence for the strain. The genome is 3.3 MB and 37.6% GC, which is smaller than A. nasoniae but larger than the genomes reported for non-culturable Arsenophonus symbionts. The genome is complex, with 6 plasmids and 11 predicted intact phage elements, but notably less complex than A. nasoniae . With 92% average nucleotide identity (ANI) to the type strain A. nasoniae , the ArsBeeUS strain isolated is clearly distinct from the type species, and we propose the name Arsenophonus apicola sp. nov. (CECT 30499; LMG 32504).

Abstract Wolbachia is a widespread, intracellular symbiont of arthropods, able to induce reproductive distortions and antiviral protection in insects. Wolbachia can also be pathogenic, as is the case with w MelPop, a virulent variant of the endosymbiont of Drosophila melanogaster . An extensive genomic amplification of the 20kb region encompassing eight Wolbachia genes, called Octomom, is responsible for w MelPop virulence. The Octomom copy number in w MelPop can be highly variable between individual D. melanogaster flies, even when comparing siblings arising from a single female. Moreover, Octomom copy number can change rapidly between generations. These data suggest an intra-host variability in Octomom copy number between Wolbachia cells. Since w MelPop Wolbachia with different Octomom copy numbers grow at different rates, we hypothesized that selection could act on this intra-host variability. Here we tested if total Octomom copy number changes during the lifespan of individual Drosophila hosts, revealing selection for different Wolbachia populations. We performed a time course analysis of Octomom amplification in flies whose mothers were controlled for Octomom copy number. We show that despite the Octomom copy number being relatively stable it increases slightly throughout D. melanogaster adult life. This indicates that there is selection acting on the intra-host variation in the Octomom copy number over the lifespan of individual hosts. This within host selection for faster replicating bacterial symbionts may be in conflict with between host selection against highly pathogenic Wolbachia .

Abstract Obligate symbioses are common in nature and present a particular challenge for functional genetic analysis. In many cases, the host is a non-model species with poor tools for genetic manipulation and the symbiont cannot be cultured or its gene expression manipulated to investigate function. Here we investigated the potential for using antisense inhibition to analyse host and symbiont gene function within an obligate aquatic symbiosis. We focused on the kinetoplastid host Bodo saltans and its bacterial symbiont, C andidatus Bodocaedibacter vickermanii, a member of Rickettsiales . We conclude that antisense inhibition is not feasible in the B. saltans and its symbiont, as the holobiont feeds on the antisense molecules – and increases in numbers – upon treatment with the antisense construct. Although our approach has proven unsuccessful, we have developed an array of protocols which can be used to study the biology of this microeukaryote and its microbial associates.

Wolbachia (Alphaproteobacteria, Rickettsiales) is an intraovarially-transmitted symbiont of insects able to exert striking phenotypes, including reproductive manipulations and pathogen blocking. These phenotypes make Wolbachia a promising tool to combat mosquito-borne diseases. Although Wolbachia is present in the majority of terrestrial arthropods, including many disease vectors, it was considered absent from Anopheles gambiae mosquitos, the main vectors of malaria in sub-Saharan Africa. In 2014, Wolbachia sequences were detected in A. gambiae samples collected in Burkina Faso. Subsequently, similar evidence came from collections all over Africa, revealing a high Wolbachia 16S sequence diversity, low abundance, and a lack of congruence between host and symbiont phylogenies. Here, we reanalyze and discuss recent evidence on the presence of Wolbachia sequences in A. gambiae. We find that although detected at increasing frequencies, the unusual properties of these Wolbachia sequences render them insufficient to diagnose natural infections in A. gambiae. Future studies should focus on uncovering the origin of Wolbachia sequence variants in Anopheles and seeking sequence-independent evidence for this new symbiosis. Understanding the ecology of Anopheles mosquitos and their interactions with Wolbachia will be key in designing successful, integrative approaches to limit malaria spread. Although the prospect of using Wolbachia to fight malaria is intriguing, the newly discovered strains do not bring it closer to realization.