Abstract DNA methylation is found throughout all domains of life, yet the extent and function of DNA methylation differ between eukaryotes. Strains of the plant pathogenic fungus Zymoseptoria tritici appeared to lack cytosine DNA methylation (5mC) because gene amplification followed by Repeat-Induced Point mutation (RIP) resulted in the inactivation of the dim2 DNA methyltransferase gene. 5mC is, however, present in closely related sister species. We demonstrate that inactivation of dim2 occurred recently as some Z. tritici isolates carry a functional dim2 gene. Moreover, we show that dim2 inactivation occurred by a different path than previously hypothesized. We mapped the genome-wide distribution of 5mC in strains with and without functional dim2 . Presence of functional dim2 correlates with high levels of 5mC in transposable elements (TEs), suggesting a role in genome defense. We identified low levels of 5mC in strains carrying inactive dim2 alleles, suggesting that 5mC is maintained over time, presumably by an active Dnmt5 DNA methyltransferase. Integration of a functional dim2 allele in strains with mutated dim2 restored normal 5mC levels, demonstrating de novo cytosine methylation activity of dim2 . To assess the importance of 5mC for genome evolution, we performed an evolution experiment, comparing genomes of strains with high levels of 5mC to genomes of strains lacking dim2 . We found that the presence of dim2 alters nucleotide composition by promoting C to T transitions (C→T) specifically at CpA (CA) sites during mitosis, likely contributing to TE inactivation. Our results show that 5mC density at TEs is a polymorphic trait in Z. tritici populations that can impact genome evolution. Author Summary Cytosine DNA methylation (5mC) is known to silence transposable elements in fungi and thereby appears to contribute to genome stability. The genomes of plant pathogenic fungi are highly diverse, differing substantially in transposon content and distribution. Here, we show extensive differences of 5mC levels within a single species of an important wheat pathogen. These differences were caused by inactivation of the DNA methyltransferase Dim2 in the majority of studied isolates. Presence of widespread 5mC increased point mutation rates in regions with active or mutated transposable elements during mitosis. The mutation pattern is dependent on the presence of Dim2 and resembles a mitotic version of Repeat-Induced Point mutation (RIP). Thus, loss of 5mC may represent an evolutionary trade-off offering adaptive potential at the cost of transposon control.

Abstract Meiosis is associated with genetic changes in the genome - via recombination, gene conversion, and mutations. The occurrence of gene conversion and mutations during meiosis may further be influenced by the chromatin conformation, in analogy to what is known for mutations during mitosis. To date, however, the exact distribution and type of meiosis-associated changes and the role of the chromatin conformation in this context is largely unexplored. Here, we determine recombination, gene conversion, and de novo mutations using whole-genome sequencing of all meiotic products of 23 individual meioses in Zymoseptoria tritici , an important pathogen of wheat. We could confirm a high genome-wide recombination rate of 65 cM/Mb and see higher recombination rates on the accessory compared to core chromosomes. A substantial fraction of 0.16% of all polymorphic markers was affected by gene conversions, showing a weak GC-bias, and occurring at higher frequency in regions of constitutive heterochromatin, indicated by the histone modification H3K9me3. The de novo mutation rate associated with meiosis was approx. three orders of magnitude higher than the corresponding mitotic mutation rate. Importantly, repeat-induced point mutation (RIP), a fungal defense mechanism against duplicated sequences, is active in Z. tritici and responsible for the majority of these de novo meiotic mutations. Our results indicate that the genetic changes associated with meiosis are a major source of variability in the genome of an important plant pathogen and shape its evolutionary trajectory. Importance The impact of meiosis on the genome composition via gene conversion and mutations is mostly poorly understood, in particular for non-model species. Here, we sequenced all four meiotic products for 23 individual meioses and determined the genetic changes caused by meiosis for the important fungal wheat pathogen Zymoseptoria tritici . We found a high rate of gene conversions and an effect of the chromatin conformation on gene conversion rates. Higher conversion rates were found in regions enriched with the H3K9me3 – a mark for constitutive heterochromatin. Most importantly, meiosis was associated with a much higher frequency of de novo mutations than mitosis. 78% of the meiotic mutations were caused by repeat-induced point mutations – a fungal defense mechanism against duplicated sequences. In conclusion, the genetic changes associated with meiosis are therefore a major factor shaping the genome of this fungal pathogen.

Background: Antagonistic co-evolution can drive rapid adaptation in pathogens and shape genome architecture. Comparative genome analyses of several fungal pathogens revealed highly variable genomes, for many species characterized by specific repeat-rich genome compartments with exceptionally high sequence variability. Dynamic genome architecture may enable fast adaptation to host genetics. The wheat pathogen Zymoseptoria tritici with its highly variable genome and has emerged as a model organism to study the genomic evolution of plant pathogens. Here, we compared genomes of Z. tritici isolates and genomes of sister species infecting wild grasses to address the evolution of genome composition and structure. Results: Using long-read technology, we sequenced and assembled genomes of Z. ardabiliae, Z. brevis, Z. pseudotritici and Z. passerinii, together with two isolates of Z. tritici. We report a high extent of genome collinearity among Zymoseptoria species and high conservation of genomic, transcriptomic and epigenomic signatures of compartmentalization. We identify high gene content variability both within and between species. In addition, such variability is mainly limited to the accessory chromosomes and accessory compartments. Despite strong host specificity and non-overlapping host-range between species, effectors are mainly shared among Zymoseptoria species, yet exhibiting a high level of presence-absence polymorphism within Z. tritici. Using in planta transcriptomic data from Z. tritici, we suggest different roles for the shared orthologs and for the accessory genes during infection of their hosts. Conclusion: Despite previous reports of high genomic plasticity in Z. tritici, we describe here a high level of conservation in genomic, epigenomic and transcriptomic signatures of genome architecture and compartmentalization across the genus Zymoseptoria. The compartmentalized genome may reflect purifying selection to retain a functional core genome and relaxed selection on the accessory genome allowing a higher extent of polymorphism.

Meiosis is a key cellular process of sexual reproduction involving the pairing of homologous sequences. In many species however, meiosis can also involve the segregation of supernumerary chromosomes, which can lack a homolog. How these unpaired chromosomes undergo meiosis is largely unknown. In this study we investigated chromosome segregation during meiosis in the haploid fungus Zymoseptoria tritici that possesses a large complement of supernumerary chromosomes. We used isogenic whole chromosome deletion strains to compare meiotic transmission of chromosomes when paired and unpaired. Unpaired chromosomes inherited from the male parent as well as paired supernumerary chromosomes showed Mendelian inheritance. In contrast, unpaired chromosomes inherited from the female parent showed non-Mendelian inheritance but were amplified and transmitted to all meiotic products. We concluded that the supernumerary chromosomes of Z. tritici show a meiotic drive and propose an additional feedback mechanism during meiosis which initiates amplification of unpaired female-inherited chromosomes.

Zymoseptoria tritici is a filamentous fungus causing Septoria tritici blotch in wheat. The pathogen has a narrow host range and infections of grasses other than susceptible wheat are blocked early after stomatal penetration. During these abortive infections the fungus shows a markedly different expression pattern. However, the underlying mechanisms causing differential gene expression during host and non-host interaction are largely unknown, but likely include transcriptional regulators responsible for the onset of an infection program in compatible hosts. In the rice blast pathogen Magnaporthe oryzae, MoCOD1, a member of the fungal Zn(II)2Cys6 transcription factor family, has been shown to directly affect pathogenicity. Here, we analyse the role of the putative transcription factor Zt107320, a homolog of MoCOD1, during infection of compatible and incompatible hosts by Z. tritici. We show for the first time that Zt107320 is differentially expressed in host versus non-host infections and that lower expression corresponds to an incompatible infection of non-hosts. Applying reverse genetics approaches we further show that Zt107320 regulates the dimorphic switch as well as the growth rate of Z. tritici and affects fungal cell wall composition in vitro. Moreover, ΔZt107320 mutants showed reduced virulence during compatible infections of wheat. We conclude that Zt107320 directly influences pathogen fitness and propose that Zt107320 regulates growth processes and pathogenicity during infection. Our results suggest that this putative transcription factor is involved in discriminating compatible and non-compatible infections.

ABSTRACT The intercellular space comprising the plant apoplast harbors a diverse range of microorganisms. The apoplastic interface represents the main compartment for interactions between proteins produced and secreted by the plant and the microbial endophytes. The outcomes of these interactions can play a role in plant cell wall metabolism, stress tolerance, and plant-pathogen resistance. So far the underlying factors that determine microbiota composition in the apoplast are not fully understood. However, it is considered that cell wall composition, nutrient availability, and the plant immune system are main determinants of microbiota composition. The plant immune system is considered to play a crucial role in modulating microbiota composition through the recognition of specific microbe-associated molecular patterns and the activation of defense responses. Hereby the plant may restrict non-beneficial microbial members and facilitate the propagation of beneficial ones. In this study, we investigated changes in the apoplastic environment during pathogen invasion using wheat as a model system. Infection of wheat with Zymoseptoria tritici, a fungal pathogen, resulted in notable alterations in the apoplast composition, reduced microbial diversity, and the accumulation of antimicrobial defense metabolites. Intriguingly, certain core microbial members persisted even in the presence of pathogen-induced immune responses, indicating their ability to evade or tolerate host immune defenses. To further explore these dynamics, we developed a protocol for extracting apoplastic fluids from wheat leaves and conducted proteome analyses to characterize the dynamic environment of the wheat leaves. Our findings uncovered a highly variable apoplastic environment that selects for microbes with specific adaptations. Notably, a core microbial community enriched in the resistant wheat cultivar exhibited antagonistic activity against Z. tritici, suggesting a potential role in conferring pathogen defense. This study advances our understanding of the dynamic interactions and adaptations of the wheat apoplastic microbiota during pathogen invasion, emphasizing the pivotal role of microbial interactions in pathogen defenses.

Entire chromosomes are typically only transmitted vertically from one generation to the next. The horizontal transfer of such chromosomes has long been considered improbable, yet gained recent support in several pathogenic fungi where it may affect the fitness or host specificity. To date, it is unknown how these transfers occur, how common they are and whether they can occur between different species. In this study, we show multiple independent instances of horizontal transfers of the same accessory chromosome between two distinct strains of the asexual entomopathogenic fungus Metarhizium robertsii during experimental co-infection of its insect host, the Argentine ant. Notably, only the one chromosome - but no other - was transferred from the donor to the recipient strain. The recipient strain, now harboring the accessory chromosome, exhibited a competitive advantage under certain host conditions. By phylogenetic analysis we further demonstrate that the same accessory chromosome was horizontally transferred in a natural environment between M. robertsii and another congeneric insect pathogen, M. guizhouense. Hence horizontal chromosome transfer is not limited to the observed frequent events within species during experimental infections but also occurs naturally across species. The transferred accessory chromosome contains genes that might be involved in its preferential horizontal transfer, encoding putative histones and histone-modifying enzymes, but also putative virulence factors that may support its establishment. Our study reveals that both intra- and interspecies horizontal transfer of entire chromosomes is more frequent than previously assumed, likely representing a not uncommon mechanism for gene exchange.

The haploid genome of the pathogenic fungus Zymoseptoria tritici is contained on “core” and “accessory” chromosomes. While 13 core chromosomes are found in all strains, as many as eight accessory chromosomes show presence/absence variation and rearrangements among field isolates. We investigated chromosome stability using experimental evolution, karyotyping and genome sequencing. We report extremely high and variable rates of accessory chromosome loss during mitotic propagation in vitro and in planta. Spontaneous chromosome loss was observed in 2 to >50 % of cells during four weeks of incubation. Similar rates of chromosome loss in the closely related Z. ardabiliae suggest that this extreme chromosome dynamic is a conserved phenomenon in the genus. Elevating the incubation temperature greatly increases instability of accessory and even core chromosomes, causing severe rearrangements involving telomere fusion and chromosome breakage. Chromosome losses do not impact the fitness of Z. tritici in vitro, but some lead to increased virulence suggesting an adaptive role of this extraordinary chromosome instability.