Summary The draft genome of the moss model, Physcomitrella patens , comprised approximately 2000 unordered scaffolds. In order to enable analyses of genome structure and evolution we generated a chromosome‐scale genome assembly using genetic linkage as well as (end) sequencing of long DNA fragments. We find that 57% of the genome comprises transposable elements ( TE s), some of which may be actively transposing during the life cycle. Unlike in flowering plant genomes, gene‐ and TE ‐rich regions show an overall even distribution along the chromosomes. However, the chromosomes are mono‐centric with peaks of a class of Copia elements potentially coinciding with centromeres. Gene body methylation is evident in 5.7% of the protein‐coding genes, typically coinciding with low GC and low expression. Some giant virus insertions are transcriptionally active and might protect gametes from viral infection via si RNA mediated silencing. Structure‐based detection methods show that the genome evolved via two rounds of whole genome duplications ( WGD s), apparently common in mosses but not in liverworts and hornworts. Several hundred genes are present in colinear regions conserved since the last common ancestor of plants. These syntenic regions are enriched for functions related to plant‐specific cell growth and tissue organization. The P . patens genome lacks the TE ‐rich pericentromeric and gene‐rich distal regions typical for most flowering plant genomes. More non‐seed plant genomes are needed to unravel how plant genomes evolve, and to understand whether the P . patens genome structure is typical for mosses or bryophytes.

Abstract Non-recombining sex chromosomes, like the mammalian Y, often lose genes and accumulate transposable elements, a process termed degeneration 1,2 . The correlation between suppressed recombination and degeneration is clear in animal XY systems 1,2 , but the absence of recombination is confounded with other asymmetries between the X and Y. In contrast, UV sex chromosomes, like those found in bryophytes, experience symmetrical population genetic conditions 3,4 . Here we test for degeneration in the bryophyte UV sex chromosome system through genomic comparisons with new female and male chromosome-scale reference genomes of the moss Ceratodon purpureus . We show that the moss sex chromosomes evolved over 300 million years ago and expanded via two chromosomal fusions. Although the sex chromosomes show signs of weaker purifying selection than autosomes, we find suppressed recombination alone is insufficient to drive gene loss on sex-specific chromosomes. Instead, the U and V sex chromosomes harbor thousands of broadly-expressed genes, including numerous key regulators of sexual development across land plants.

ABSTRACT Premise of the study New sequencing technologies enable the possibility of generating large-scale molecular datasets for constructing the plant tree of life. We describe a new probe set for target enrichment sequencing to generate nuclear sequence data to build phylogenetic trees with any flagellate plants, comprising hornworts, liverworts, mosses, lycophytes, ferns, and gymnosperms. Methods and Results We leveraged existing transcriptome and genome sequence data to design a set of 56,989 probes for target enrichment sequencing of 451 nuclear exons and non-coding flanking regions across flagellate plant lineages. We describe the performance of target enrichment using the probe set across flagellate plants and demonstrate the potential of the data to resolve relationships among both ancient and closely related taxa. Conclusions A target enrichment approach using the new probe set provides a relatively low-cost solution to obtain large-scale nuclear sequence data for inferring phylogenetic relationships across flagellate plants.

Abstract The evolution of mutualism depends critically upon genetic variation in the fitness benefit to both partners. Estimates of these quantities are rare, however, because genetic variation for the interaction may be absent, aspects of the interaction may not be amenable to experimental manipulation, or the benefits to one partner may be unknown. In vitro experiments show that female mosses produce odors which attract sperm-dispersing microarthropods, but the fitness consequences of this interaction for either partner are unknown. Here we established experimental mesocosms to test for a commensal effect of sperm-dispersing microarthropods on moss reproduction. We found that of moss grown with microarthropods showed increased moss reproductive rates by five times, relative to control mesocosms, but remarkably also increased the number of reproducing genotypes, and changed the rank-order of fitness for both male and female genotypes. These results provide an estimate of the fitness benefit for mosses in the presence of microarthropods, and highlight the potential for biotic dispersal agents to alter fitness among moss genotypes in this relationship.

ABSTRACT PREMISE OF THE STUDY A period of allopatry is widely believed to be essential for the evolution of reproductive isolation. However, strict allopatry may be difficult to achieve in some cosmopolitan, spore-dispersed groups, like mosses. Here we examine the genetic and genome size diversity in Mediterranean populations of the moss Ceratodon purpureus s.l. to evaluate the role of allopatry and ploidy change in population divergence. METHODS We sampled populations of the genus Ceratodon from mountainous areas and lowlands of the Mediterranean region, and from western and central Europe. We performed phylogenetic and coalescent analyses on sequences from five nuclear introns and a chloroplast locus to reconstruct their evolutionary history. We also estimated the genome size using flow cytometry, employing propidium iodide, and determined their sex using a sex-linked PCR marker. KEY RESULTS Two well differentiated clades were resolved, discriminating two homogeneous groups: the widespread C. purpureus and a local group mostly restricted to the mountains in southern Spain. The latter also possessed a genome size 25% larger than the widespread C. purpureus , and the samples of this group consist entirely of females. We also found hybrids, and some of them had a genome size equivalent to the sum of the C. purpureus and Spanish genome, suggesting that they arose by allopolyploidy. CONCLUSIONS These data suggest that a new species of Ceratodon arose via peripatric speciation, potentially involving a genome size change and a strong female-biased sex ratio. The new species has hybridized in the past with C. purpureus .

Abstract The development of CRISPR technologies provides a powerful tool for understanding the evolution and functionality of essential biological processes. Here we demonstrate successful CRISPR-Cas9 genome editing in the dioecious moss species, Ceratodon purpureus . Using an existing selection system from the distantly related hermaphroditic moss, Physcomitrium patens , we generated knock-outs of the APT reporter gene by employing CRISPR targeted mutagenesis under expression of native U6 snRNA promoters. Next, we used the native homology-directed repair (HDR) pathway, combined with CRISPR-Cas9, to knock-in two reporter genes under expression of an endogenous RPS5A promoter in a newly developed landing site in C. purpureus . Our results show that the molecular tools developed in P. patens can be extended to other mosses across this ecologically important and developmentally variable group. These findings pave the way for precise and powerful experiments aimed at identifying the genetic basis of key functional variation within the bryophytes and between the bryophytes and other land plants. Significance Statement We have developed CRISPR-Cas9 genome editing tools and protocols for the sexually dimorphic moss, Ceratodon purpureus to generate gene knock-outs and knock-ins within targeted loci. This work facilitates future functional genomic experiments in this fast growing, haploid, dioecious system and suggests these tools will function across much of moss diversity.

Mosses are critical components of boreal ecosystems where they typically account for a large proportion of net primary productivity and harbor diverse bacterial communities that can be the major source of biologically-fixed nitrogen in these ecosystems. Despite their ecological importance, we have limited understanding of how microbial communities vary across boreal moss species and the extent to which local environmental conditions may influence the composition of these bacterial communities. We used marker gene sequencing to analyze bacterial communities associated with eight boreal moss species collected near Fairbanks, AK USA. We found that host identity was more important than site in determining bacterial community composition and that mosses harbor diverse lineages of potential N2-fixers as well as an abundance of novel taxa assigned to understudied bacterial phyla (including candidate phylum WPS-2). We performed shotgun metagenomic sequencing to assemble genomes from the WPS-2 candidate phylum and found that these moss-associated bacteria are likely anoxygenic phototrophs capable of carbon fixation via RuBisCo with an ability to utilize byproducts of photorespiration from hosts via a glyoxylate shunt. These results give new insights into the metabolic capabilities of understudied bacterial lineages that associate with mosses and the importance of plant hosts in shaping their microbiomes.

Mosses have long served as models for studying many areas of plant biology. Investigators have used two-dimensional measurements of juvenile growth from photographs as a surrogate for dry-weight biomass. The relationship between area and biomass, however, has not been critically evaluated. Here we grew axenic tissue cultures of ten Ceratodon purpureus isolates to study the relationship between these parameters. We measured area and biomass on replicate cultures with two distinct starting inoculum sizes each week for three weeks and examined the correlation between area and biomass as well as the influence of variation in inoculum size on both parameters. We found a strong correlation between area and biomass after two weeks of growth. Furthermore, we found inoculum size affected biomass during the first week of growth but not subsequent weeks and inoculum size had no detectible effect on area. These analyses provide experimental confirmation that area is a suitable proxy for biomass and provide clear guidelines for when inoculum size variation may affect downstream growth estimates.

Abstract Alternative splicing (AS) is controlled by cis -regulatory elements recognized by networks of trans -acting factors. Here we investigate modes and mechanisms of AS co-regulation by MBNL1 and RBFOX1, two RNA binding proteins (RBPs) critical for developmental AS transitions. We generated two cell models that express each RBP under separate inducible promoters. Transcriptome-wide categorization of the impacts of RBFOX1 expression on MBNL1 splicing revealed a common co-regulatory mode through which RBFOX1 buffers MBNL1 dose-dependent splicing regulation by reducing the total range of exon inclusion or exclusion. Minigene mutational analysis and in vitro binding experiments suggest that this buffering mechanism occurs through a shared cis -regulatory element previously unidentified as critical for MBNL1-dependent activity. Overall, our studies define a conserved co-regulatory mechanism through which RBFOX1 and MBNL1 can fine-tune and provide redundancy for AS outcomes. These studies indicate overlapping use of RNA motifs with potential implications for when activity of RBPs is disrupted.