The nucleotide analog Remdesivir (RDV) is the only FDA-approved antiviral therapy to treat infection by severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2). The physical basis for efficient utilization of RDV by SARS-CoV-2 polymerase is unknown. Here, we characterize the impact of RDV and other nucleotide analogs on RNA synthesis by the polymerase using a high-throughput, single-molecule, magnetic-tweezers platform. The location of the modification in the ribose or in the base dictates the catalytic pathway(s) used for its incorporation. We reveal that RDV incorporation does not terminate viral RNA synthesis, but leads the polymerase into deep backtrack, which may appear as termination in traditional ensemble assays. SARS-CoV-2 is able to evade the endogenously synthesized product of the viperin antiviral protein, ddhCTP, though the polymerase incorporates this nucleotide analog well. This experimental paradigm is essential to the discovery and development of therapeutics targeting viral polymerases.

Abstract Coronaviruses have evolved elaborate multisubunit machines to replicate and transcribe their genomes. Central to these machines are the RNA-dependent RNA polymerase subunit (nsp12) and its intimately associated cofactors (nsp7 and nsp8). We have used a high-throughput magnetic-tweezers approach to develop a mechanochemical description of this core polymerase. The core polymerase exists in at least three catalytically distinct conformations, one being kinetically consistent with incorporation of incorrect nucleotides. We provide the first evidence that an RdRp uses a thermal ratchet instead of a power stroke to transition from the pre- to post-translocated state. Ultra-stable magnetic tweezers enables the direct observation of coronavirus polymerase deep and long-lived backtrack that are strongly stimulated by secondary structure in the template. The framework presented here elucidates one of the most important structure-dynamics-function relationships in human health today, and will form the grounds for understanding the regulation of this complex.

Abstract Transcription initiation is the first step in gene expression, and is therefore strongly regulated in all domains of life. The RNA polymerase (RNAP) first associates with the initiation factor σ to form a holoenzyme, which binds, bends and opens the promoter in a succession of reversible states. These states are critical for transcription regulation, but remain poorly understood. Here, we addressed the mechanism of open complex formation by monitoring its assembly/disassembly kinetics on individual consensus lacUV5 promoters using high-throughput single-molecule magnetic tweezers. We probed the key protein–DNA interactions governing the open-complex formation and dissociation pathway by modulating the dynamics at different concentrations of monovalent salts and varying temperatures. Consistent with ensemble studies, we observed that RP O is a stable, slowly reversible state that is preceded by a kinetically significant open intermediate (RP I ), from which the holoenzyme dissociates. A strong anion concentration and type dependence indicates that the RP O stabilization may involve sequence-independent interactions between the DNA and the holoenzyme, driven by a non-Coulombic effect consistent with the non-template DNA strand interacting with σ and the RNAP β subunit. The temperature dependence provides the energy scale of open-complex formation and further supports the existence of additional intermediates.

Abstract RNA plays critical roles in the transmission and regulation of genetic information and is increasingly used in biomedical and biotechnological applications. Functional RNAs contain extended double-stranded regions and the structure of double-stranded RNA (dsRNA) has been revealed at high-resolution. However, the dependence of the properties of the RNA double helix on environmental effects, notably temperature, is still poorly understood. Here, we use single-molecule magnetic tweezers measurements to determine the dependence of the dsRNA twist on temperature. We find that dsRNA unwinds with increasing temperature, even more than DNA, with Δ Tw RNA = −14.4 ± 0.7 º/(°C·kbp), compared to Δ Tw DNA = −11.0 ± 1.2 º/(°C·kbp). All-atom molecular dynamics (MD) simulations using a range of nucleic acid force fields, ion parameters, and water models correctly predict that dsRNA unwinds with rising temperature, but significantly underestimate the magnitude of the effect. These MD data, together with additional MD simulations involving DNA and DNA-RNA hybrid duplexes, reveal a linear correlation between twist temperature decrease and the helical rise, in line with DNA but at variance with RNA experimental data. We speculate that this discrepancy might be caused by some unknown bias in the RNA force fields tested, or by as yet undiscovered transient alternative structures in the RNA duplex. Our results provide a baseline to model more complex RNA assemblies and to test and develop new parameterizations for RNA simulations. They may also inspire physical models of temperature-dependent dsRNA structure.

Coronaviruses (CoV) encode sixteen non-structural proteins (nsps), most of which form the replication-transcription complex (RTC). The RTC contains a core composed of one nsp12 RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), two nsp8s and one nsp7. The core RTC recruits other nsps to synthesize all viral RNAs within the infected cell. While essential for viral replication, the mechanism by which the core RTC assembles into a processive polymerase remains poorly understood. We show that the core RTC preferentially assembles by first having nsp12-polymerase bind to the RNA template, followed by the subsequent association of nsp7 and nsp8. Once assembled on the RNA template, the core RTC requires hundreds of seconds to undergo a conformational change that enables processive elongation. In the absence of RNA, the (apo-)RTC requires several hours to adopt its elongation-competent conformation. We propose that this obligatory activation step facilitates the recruitment of additional nsps essential for efficient viral RNA synthesis and may represent a promising target for therapeutic interventions.

Single molecule biophysics experiments have enabled the observation of biomolecules with a great deal of precision in space and time, e.g. nucleic acids mechanical properties and protein-nucleic acids interactions using force and torque spectroscopy techniques. The success of these experiments strongly depends on the capacity of the researcher to design and fabricate complex nucleic acid scaffolds, as the pertinence and the yield of the experiment strongly depend on the high quality and purity of the final scaffold. Though the molecular biology techniques involved are well known, the fabrication of nucleic acids scaffold for single molecule experiments still remains a difficult task. Here, we present new protocols to generate high quality coilable double-stranded DNA and RNA, as well as DNA and RNA hairpins with ~500-1000 bp long stems. Importantly, we present a new approach based on single-stranded DNA's annealing and show, using magnetic tweezers, that it is more efficient to generate complex nucleic acid scaffolds in larger amount and at higher purity than a standard PCR-digestion-ligation approach. The protocols we describe here enable the design of any sort of complex nucleic acid scaffold for single molecule biophysics experiments and will therefore be extremely valuable to the community.

Abstract Long double-stranded (ds) RNA in the cytosol acts as a potent inflammatory molecule recognized by the receptor MDA5, triggering the innate immune response. Mutations in MDA5 affecting dsRNA recognition can lead to increased infection sensitivity or autoimmune disease. The current model proposes that MDA5 nucleoprotein filament assembly-disassembly dynamics regulates long dsRNA recognition and signaling. We show that MDA5 preferentially loads onto dsRNA via a 3’ recessed end and uses ATP hydrolysis to translocate towards the 5’-end until obstructed, such as by another MDA5 on the opposite strand. Multiple MDA5 monomers accumulate at the blockade, forming a partial filament that extrudes the associated RNA in single-stranded loops and thereby compacting the MDA5-RNA complex. The compacted state is further stabilized by oligomerization of the MDA5’s caspase recruitment domain (CARD) and can withstand significant forces, offering an alternative intermediate in the activation of MDA5-dependent innate immunity.

RNA virus survival depends on efficient viral genome replication, which is performed by the viral RNA dependent RNA polymerase (RdRp). The recent development of high throughput magnetic tweezers has enabled the simultaneous observation of dozens of viral RdRp elongation traces on kilobases long templates, and this has shown that RdRp nucleotide addition kinetics is stochastically interrupted by rare pauses of 1-1000 s duration, of which the short-lived ones (1-10 s) are the temporal signature of a low fidelity catalytic pathway. We present a simple and precise temperature controlled system for magnetic tweezers to characterize the replication kinetics temperature dependence between 25 deg. and 45 deg. of RdRps from three RNA viruses, i.e. the double-stranded RNA bacteriophage phi6, and the positive-sense single-stranded RNA poliovirus (PV) and human rhinovirus C (HRV-C). We found that phi6 RdRp is largely temperature insensitive, while PV and HRV-C RdRps replication kinetics are activated by temperature. Furthermore, the activation energies we measured for PV RdRp catalytic state corroborate previous estimations from ensemble pre-steady state kinetic studies, further confirming the catalytic origin of the short pauses and their link to temperature independent RdRp fidelity. This work will enable future temperature controlled study of biomolecular complex at the single molecule level.