ABSTRACT Objectives Thrombotic and microvascular complications are frequently seen in deceased COVID-19 patients. However, whether this is caused by direct viral infection of the endothelium or inflammation-induced endothelial activation remains highly contentious. Methods Here, we use patient autopsy samples, primary human endothelial cells and an in vitro model of the pulmonary epithelial-endothelial cell barrier to show that primary human endothelial cells express very low levels the SARS-CoV-2 receptor ACE2 and the protease TMPRSS2. Results Accordingly, endothelial cells can only be infected when SARS-CoV-2 is present at very high concentrations. However, this is not a productive infection (i.e. no infectious virus is produced) and viral entry induces an inflammatory response. We also show that SARS-CoV-2 does not infect endothelial cells in 3D vessels under flow conditions. We further demonstrate that in a co-culture model endothelial cells are not infected with SARS-CoV-2. They do however sense and respond to infection in the adjacent epithelial cells, increasing ICAM-1 expression and releasing pro-inflammatory cytokines. Conclusions Taken together, these data suggest that in vivo , endothelial cells are unlikely to be infected with SARS-CoV-2 and that infection is only likely to occur if the adjacent pulmonary epithelium is denuded (basolateral infection) or a high viral load is present in the blood (apical infection). In such a scenario, whilst SARS-CoV-2 infection of the endothelium can occur, it does not contribute to viral amplification. However, endothelial cells are still likely to play a key role in SARS-CoV-2 pathogenesis by sensing adjacent infection and mounting a pro-inflammatory response to SARS-CoV-2.

Abstract Macrophages are key cellular contributors to COVID-19 pathogenesis. Whether SARS-CoV-2 can enter macrophages, replicate and release new viral progeny remains controversial. Similarly, whether macrophages need to sense replicating virus to drive cytokine release is also unclear. Macrophages are heterogeneous cells poised to respond to their local microenvironment, and accordingly, the SARS-CoV-2 entry receptor ACE2 is only present on a subset of macrophages at sites of human infection. Here, we use in vitro approaches to investigate how SARS-CoV-2 interacts with ACE2-negative and ACE2-positive human macrophages and determine how these macrophage populations sense and respond to SARS-CoV-2. We show that SARS-CoV-2 does not replicate within ACE2-negative human macrophages and does not induce pro-inflammatory cytokine expression. By contrast, ACE2 expression in human macrophages permits SARS-CoV-2 entry, replication, and virion release. ACE2-expressing macrophages sense replicating virus to trigger pro-inflammatory and anti-viral programs that limit virus release. These combined findings resolve several controversies regarding macrophage-SARS-CoV-2 interactions and identify a signaling circuit by which macrophages sense SARS-CoV-2 cell entry and respond by restricting viral replication. One sentence summary Lack of macrophage ACE2 expression precludes SARS-CoV-2 entry and sensing, while ACE2-expressing macrophages sense intramacrophage SARS-CoV-2 replication to induce rapid anti-viral responses that limit new virion release.

ABSTRACT The assembly of a mature vascular network involves the coordinated control of cell shape changes to regulate morphogenesis of a complex vascular network. Cellular changes include a process of endothelial cell (EC) elongation which is essential for establishing appropriately sized lumens during vessel maturation 1-3 . However how EC elongation is dynamically regulated in vivo is not fully understood since live monitoring of this event can be challenging in animal models. Here, we utilise the live imaging capacity of the zebrafish to explore how integrin adhesion complexes, known as Focal Adhesions (FAs), control EC dynamics in live flow pressured vasculature. To do this, we generated a zebrafish mutant, deficient for the integrin adaptor protein Talin1. Notably, unlike the severe cardiovascular defects that arise in Talin1 knockout mice 4 , vasculogenesis still occurs normally talin1 mutants and cardiac output remains sufficient up to two days post fertilisation (dpf). This allowed us to uncouple primary roles for FAs in ECs during subsequent morphogenesis events, including angiogenesis and vessel remodelling, without interference of secondary effects that might occur due to systemic vessel failure or loss of blood flow. We further established a FA marker line, expressing endothelial Vinculin-eGFP, and demonstrated that FAs are lost in our talin1 mutants. This Vinculin transgene represents the first in vivo model to monitor endothelial FA dynamics. Loss of FAs in talin1 mutants, leads to compromised F-actin rearrangements, which perturb EC elongation and cell-cell junction linearisation during vessel remodelling. Chemical induction of actin polymerisation can restore these cellular phenotypes, suggesting a recovery of actin rearrangements that are sufficient to allow cell and junction shape changes. Together, we have identified that FAs are essential for active guidance of EC elongation and junction linearisation in flow pressured vessels. These observations can explain the severely compromised vessel beds, haemorrhage and vascular leakage that has been observed in mouse models that lack integrin signalling 4-8 .

Endothelial cells lining the blood vessel wall communicate intricately with the surrounding extracellular matrix, translating mechanical cues into biochemical signals. Moreover, vessels require the capability to enzymatically degrade the matrix surrounding them, to facilitate vascular expansion. c-Src plays a key role in blood vessel growth, with its loss in the endothelium reducing vessel sprouting and focal adhesion signalling. Here, we show that constitutive activation of c-Src in endothelial cells results in rapid vascular expansion, operating independently of growth factor stimulation or fluid shear stress forces. This is driven by an increase in focal adhesion signalling and size, with enhancement of localised secretion of matrix metalloproteinases responsible for extracellular matrix remodelling. Inhibition of matrix metalloproteinase activity results in a robust rescue of the vascular expansion elicited by heightened c-Src activity. This supports the premise that moderating focal adhesion-related events and matrix degradation can counteract abnormal vascular expansion, with implications for pathologies driven by unusual vascular morphologies.

G3BP1 (Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) is widely recognized as a core component of stress granules (SG), non-membranous RNA-protein-assemblies required for cellular survival under stress. We report that in the absence of SG, G3BP1 acts as lysosomal anchor of the Tuberous Sclerosis Complex (TSC) protein complex. By tethering the TSC complex to lysosomes, G3BP1 suppresses signaling through the metabolic master regulator mTORC1 (mechanistic target of rapamycin complex 1). Like the known TSC complex subunits, G3BP1 suppresses phenotypes related to mTORC1 hyperactivity in the context of tumors and neuronal dysfunction. Thus, G3BP1 is not only a core component of SG but also a key element of lysosomal TSC-mTORC1 signaling.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.