Vaccines are urgently needed to control the ongoing pandemic COVID-19 and previously emerging MERS/SARS caused by coronavirus (CoV) infections. The CoV spike receptor-binding domain (RBD) is an attractive vaccine target but is undermined by limited immunogenicity. We describe a dimeric form of MERS-CoV RBD that overcomes this limitation. The RBD-dimer significantly increased neutralizing antibody (NAb) titers compared to conventional monomeric form and protected mice against MERS-CoV infection. Crystal structure showed RBD-dimer fully exposed dual receptor-binding motifs, the major target for NAbs. Structure-guided design further yielded a stable version of RBD-dimer as a tandem repeat single-chain (RBD-sc-dimer) which retained the vaccine potency. We generalized this strategy to design vaccines against COVID-19 and SARS, achieving 10- to 100-fold enhancement of NAb titers. RBD-sc-dimers in pilot scale production yielded high yields, supporting their scalability for further clinical development. The framework of immunogen design can be universally applied to other beta-CoV vaccines to counter emerging threats.

BackgroundAlthough several COVID-19 vaccines have been developed so far, they will not be sufficient to meet the global demand. Development of a wider range of vaccines, with different mechanisms of action, could help control the spread of SARS-CoV-2 globally. We developed a protein subunit vaccine against COVID-19 using a dimeric form of the receptor-binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 spike protein as the antigen. We aimed to assess the safety and immunogenicity of this vaccine, ZF2001, and determine the appropriate dose and schedule for an efficacy study.MethodsWe did two randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1 and phase 2 trials. Phase 1 was done at two university hospitals in Chongqing and Beijing, China, and phase 2 was done at the Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention in Xiangtan, China. Healthy adults aged 18–59 years, without a history of SARS-CoV or SARS-CoV-2 infection, an RT-PCR-positive test result for SARS-CoV-2, a history of contact with confirmed or suspected COVID-19 cases, and severe allergies to any component of the vaccine were eligible for enrolment. In phase 1, participants were randomly assigned (2:2:1) to receive three doses of the vaccine (25 μg or 50 μg) or placebo intramuscularly, 30 days apart. In phase 2, participants were randomly assigned (1:1:1:1:1:1) to receive the vaccine (25 μg or 50 μg) or placebo intramuscularly, 30 days apart, in either a two-dose schedule or a three-dose schedule. Investigators, participants, and the laboratory team were masked to group allocation. For phase 1, the primary outcome was safety, measured by the occurrence of adverse events and serious adverse events. For phase 2, the primary outcome was safety and immunogenicity (the seroconversion rate and the magnitude, in geometric mean titres [GMTs], of SARS-CoV-2-neutralising antibodies). Analyses were done on an intention-to-treat and per-protocol basis. These trials are registered with ClinicalTrials.gov (NCT04445194 and NCT04466085) and participant follow-up is ongoing.FindingsBetween June 22 and July 3, 2020, 50 participants were enrolled into the phase 1 trial and randomly assigned to receive three doses of placebo (n=10), the 25 μg vaccine (n=20), or the 50 μg vaccine (n=20). The mean age of participants was 32·6 (SD 9·4) years. Between July 12 and July 17, 2020, 900 participants were enrolled into the phase 2 trial and randomly assigned to receive two doses of placebo (n=150), 25 μg vaccine (n=150), or 50 μg vaccine (n=150), or three doses of placebo (n=150), 25 μg vaccine (n=150), or 50 μg vaccine (n=150). The mean age of participants was 43·5 (SD 9·2) years. In both phase 1 and phase 2, adverse events reported within 30 days after vaccination were mild or moderate (grade 1 or 2) in most cases (phase 1: six [60%] of ten participants in the placebo group, 14 [70%] of 20 in the 25 μg group, and 18 [90%] of 20 in the 50 μg group; phase 2: 37 [25%] of 150 in the two-dose placebo group, 43 [29%] of 150 in the two-dose 25 μg group, 50 [33%] of 150 in the two-dose 50 μg group, 47 [31%] of 150 in the three-dose placebo group, 72 [48%] of 150 in the three-dose 25 μg group, and 65 [43%] of 150 in the three-dose 50 μg group). In phase 1, two (10%) grade 3 or worse adverse events were reported in the 50 μg group. In phase 2, grade 3 or worse adverse events were reported by 18 participants (four [3%] in the two-dose 25 μg vaccine group, two [1%] in the two-dose 50 μg vaccine group, two [1%] in the three-dose placebo group, four [3%] in the three-dose 25 μg vaccine group, and six [4%] in the three-dose 50 μg vaccine group), and 11 were considered vaccine related (two [1%] in the two-dose 25 μg vaccine group, one [1%] in the two-dose 50 μg vaccine group, one [1%] in the three-dose placebo group, two [1%] in the three-dose 25 μg vaccine group, and five [3%] in the three-dose 50 μg vaccine group); seven participants reported serious adverse events (one [1%] in the two-dose 25 μg vaccine group, one [1%] in the two-dose 50 μg vaccine group, two [1%] in the three-dose placebo group, one [1%] in the three-dose 25 μg vaccine group, and two [1%] in the three-dose 50 μg vaccine group), but none was considered vaccine related. In phase 2, on the two-dose schedule, seroconversion rates of neutralising antibodies 14 days after the second dose were 76% (114 of 150 participants) in the 25 μg group and 72% (108 of 150) in the 50 μg group; on the three-dose schedule, seroconversion rates of neutralising antibodies 14 days after the third dose were 97% (143 of 148 participants) in the 25 μg group and 93% (138 of 148) in the 50 μg group. In the two-dose groups in phase 2, the SARS-CoV-2-neutralising GMTs 14 days after the second dose were 17·7 (95% CI 13·6–23·1) in the 25 μg group and 14·1 (10·8–18·3) in the 50 μg group. In the three-dose groups in phase 2, the SARS-CoV-2-neutralising GMTs 14 days after the third dose were 102·5 (95% CI 81·8–128·5) in the 25 μg group and 69·1 (53·0–90·0) in the 50 μg group.InterpretationThe protein subunit vaccine ZF2001 appears to be well tolerated and immunogenic. The safety and immunogenicity data from the phase 1 and 2 trials support the use of the 25 μg dose in a three-dose schedule in an ongoing phase 3 trial for large-scale evaluation of ZF2001's safety and efficacy.FundingNational Program on Key Research Project of China, National Science and Technology Major Projects of Drug Discovery, Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences, and Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical.TranslationFor the Chinese translation of the abstract see Supplementary Materials section.

Abstract A safe, efficacious and deployable vaccine is urgently needed to control COVID-19 pandemic. We report here the preclinical development of a COVID-19 vaccine candidate, ZF2001, which contains tandem-repeat dimeric receptor-binding domain (RBD) protein with alum-based adjuvant. We assessed vaccine immunogenicity and efficacy in both mice and non-human primates (NHPs). ZF2001 induced high levels of RBD-binding and SARS-CoV-2 neutralizing antibody in both mice and NHPs, and also elicited balanced T H 1/T H 2 cellular responses in NHPs. Two doses of ZF2001 protected Ad-hACE2-transduced mice against SARS-CoV-2 infection, as detected by reduced viral RNA and relieved lung injuries. In NHPs, vaccination of either 25 μg or 50 μg ZF2001 prevented infection with SARS-CoV-2 in lung, trachea and bronchi, with milder lung lesions. No evidence of disease enhancement is observed in both models. ZF2001 is being evaluated in the ongoing international multi-center Phase 3 trials ( NCT04646590 ) and has been approved for emergency use in Uzbekistan.

Digital microfluidics (DMF) features programmed manipulation of fluids in multiple steps, making it a valuable tool for sample pretreatment. However, the integration of sample pretreatment with its downstream reaction and detection requires transferring droplets from the DMF device to the outside world. To address this issue, the present study developed a modified DMF device that allows automated droplet ejection out of the chip, facilitated by a tailor-designed interface. A double-layered DMF microchip with an oil-filled medium was flipped over, with a liquid infusion port and a liquid expulsion port accommodated on the top working PCB plate and the bottom grounded ITO plate, respectively, to facilitate chip-to-world delivery of droplets. Using chemiluminescent immunoassay (CLIA) as an illustrative application, the sample pretreatment was programmed on the DMF device, and CLIA droplets were ejected from the chip for signal reading. In our workflow, CLIA droplets can be ejected from the DMF device through the chip-to-world interface, freeing up otherwise occupied electrodes for more sample pretreatment and enabling streamlined droplet microreactions and batch-mode operation for bioanalysis. Integrated with these interfacing portals, the DMF system achieved a single-channel throughput of 17 samples per hour, which can be further upscaled for more productive applications by parallelizing the DMF modules. The results of this study demonstrate that the droplet ejection function that is innovated in a DMF sample pretreatment microsystem can significantly improve analytical throughput, providing an approach to establishing an automated but decentralized biochemical sample preparation workstation for large-scale and continuous bioanalysis.