Abstract A central tenet in the design of vaccines is the display of native-like antigens in the elicitation of protective immunity. The abundance of N-linked glycans across the SARS-CoV-2 spike protein is a potential source of heterogeneity between the many different vaccine candidates under investigation. Here, we investigate the glycosylation of recombinant SARS-CoV-2 spike proteins from five different laboratories and compare them against infectious virus S protein. We find patterns which are conserved across all samples and this can be associated with site-specific stalling of glycan maturation which act as a highly sensitive reporter of protein structure. Molecular dynamics (MD) simulations of a fully glycosylated spike support s a model of steric restrictions that shape enzymatic processing of the glycans. These results suggest that recombinant spike-based SARS-CoV-2 immunogen glycosylation reproducibly recapitulates signatures of viral glycosylation.

ABSTRACT The Spike protein of SARS-CoV-2 is essential for virus entry into human cells. In fact, most neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 are directed against the Spike, making it the antigen of choice for use in vaccines and diagnostic tests. In the current pandemic context, global demand for Spike proteins has rapidly increased and could exceed hundreds of grams to kilograms annually. Coronavirus Spikes are large, heavily glycosylated, homotrimeric complexes, with inherent instability. Their poor manufacturability now threatens availability of these proteins for vaccines and diagnostic tests. Here, we outline a scalable, GMP-compliant, chemically defined process for production of a cell secreted, stabilized form of the trimeric Spike protein. The process is chemically defined and based on clonal, suspension-CHO cell populations and on protein purification via a two-step, scalable downstream process. The trimeric conformation was confirmed using electron microscopy and HPLC analysis. Binding to susceptible cells was shown using a virus-inhibition assay. The diagnostic sensitivity and specificity for detection of serum SARS-CoV-2 specific IgG1 was investigated and found to exceed that of Spike fragments (S1 and RBD). The process described here will enable production of sufficient high-quality trimeric Spike protein to meet the global demand for SARS-CoV-2 vaccines and diagnostic tests.

ABSTRACT Global control of COVID-19 will require the deployment of vaccines capable of inducing long-term protective immunity against SARS-CoV-2 variants. In this report, we describe an adjuvanted subunit candidate vaccine that affords elevated, sustained and cross-variant SARS-CoV-2 neutralising antibodies (NAbs) in multiple animal models. Alhydroxiquim-II is a TLR7/8 small-molecule agonist chemisorbed on aluminium hydroxide. Vaccination with Alhydroxiquim-II combined with a stabilized, trimeric form of the SARS-CoV-2 spike protein (termed CoVac-II) resulted in high-titre NAbs in mice, with no decay in responses over an 8-month period. NAbs from sera of CoVac-II-immunized mice, horses and rabbits were broadly neutralising against SARS-CoV-2 variants. Boosting long-term CoVac-II-immunized mice with adjuvanted spike protein from the Beta variant markedly increased levels of NAb titres against multiple SARS-CoV-2 variants; notably high titres against the Delta variant were observed. These data strongly support the clinical assessment of Alhydroxiquim-II-adjuvanted spike proteins to protect against SARS-CoV-2 variants of concern.