Understanding human development is of fundamental biological and clinical importance. Despite its significance, mechanisms behind human embryogenesis remain largely unknown. Here, we attempt to model human early embryo development with expanded pluripotent stem cells (EPSCs) in 3-dimensions. We define a protocol that allows us to generate self-organizing cystic structures from human EPSCs that display some hallmarks of human early embryogenesis. These structures mimic polarization and cavitation characteristic of pre-implantation development leading to blastocyst morphology formation and the transition to post-implantation-like organization upon extended culture. Single-cell RNA sequencing of these structures reveals subsets of cells bearing some resemblance to epiblast, hypoblast and trophectoderm lineages. Nevertheless, significant divergences from natural blastocysts persist in some key markers, and signalling pathways point towards ways in which morphology and transcriptional-level cell identities may diverge in stem cell models of the embryo. Thus, this stem cell platform provides insights into the design of stem cell models of embryogenesis.

ABSTRACT Understanding human development is of fundamental biological and clinical importance. Yet despite its significance, insights into early developmental events in humans still remain largely unknown. While recent advances show that stem cells can mimic embryogenesis 1–9 to unravel hidden developmental mechanisms, a stem cell-based model of early human embryogenesis is lacking. Here, we use human extended pluripotent stem cells 10 to reconstitute early human development in 3-dimensions and recapitulate early embryo-like events. We first perform a systematic characterisation to reveal unique signalling requirements for building the human pre-implantation blastocyst. Further, we show that these in vitro stem cell-derived blastocyst-like structures are able to undertake spatiotemporal self-organisation to mimic peri-implantation remodelling in which a polarised rosette opens up the amniotic cavity within a developing disc. The hallmarks of human early development displayed by this stem cell-based in vitro model mimics features of embryonic day 3 to day 9/10 of natural development. Thus, this platform represents a tractable model system to contribute to the basic understanding of cellular and molecular mechanisms governing early embryonic events in humans and to provide valuable insights into the design of differentiation protocols for human stem cells in clinical applications.

ABSTRACT We recently described an unconventional mode of gene regulation in budding yeast by which transcriptional and translational interference were used in an integrated manner to down-regulate protein expression. Developmentally timed transcriptional interference inhibited production of a well translated mRNA isoform and resulted in the production of an mRNA isoform containing inhibitory upstream open reading frames (uORFs) that blocked translation of the ORF. Transcriptional interference and uORF-based translational repression are established mechanisms outside of yeast, but whether this type of integrated regulation was conserved was unknown. Here we find that, indeed, a similar type of regulation occurs at the locus for the human oncogene MDM2 . We observe evidence of transcriptional interference between the two MDM2 promoters, which produce a poorly translated distal promoter-derived uORF-containing mRNA isoform and a well-translated proximal promoter-derived transcript. Down-regulation of distal promoter activity markedly up-regulates proximal promoter-driven expression and results in local reduction of histone H3K36 trimethylation. Moreover, we observe that this transcript toggling between the two MDM2 isoforms naturally occurs during human embryonic stem cell differentiation programs.

Neighboring sequences of a gene can influence its expression. In the phenomenon known as transcriptional interference, transcription at one region in the genome can repress transcription at a nearby region in cis. Transcriptional interference occurs at a number of eukaryotic loci, including the alcohol dehydrogenase (Adh) gene in Drosophila melanogaster. Adh is regulated by two promoters, which are distinct in their developmental timing of activation. It has been shown using transgene insertion that when the promoter distal from the Adh start codon is deleted, transcription from the proximal promoter becomes de-regulated. As a result, the Adh proximal promoter, which is normally active only during the early larval stages, becomes abnormally activated in adults. Whether this type of regulation occurs in the endogenous Adh context, however, remains unclear. Here, we employed the CRISPR/Cas9 system to edit the endogenous Adh locus and found that removal of the distal promoter does also result in the untimely expression of the proximal promoter-driven mRNA isoform in adults, albeit at lower levels than previously reported. Importantly, we show that transcription from the distal promoter is sufficient to repress proximal transcription in larvae and that the degree of this repression depends on the degree of distal promoter activity. Finally, repression of the endogenous Adh proximal promoter is associated with the enrichment of histone 3 lysine 36 trimethylation (H3K36me3), a chromatin mark necessary for transcription-coupled gene repression in yeast. We conclude that the endogenous Adh locus is developmentally regulated by transcriptional interference in a tunable manner.

Long Undecoded Transcript Isoforms (LUTIs) represent a class of non-canonical mRNAs that downregulate gene expression through the combined act of transcriptional and translational repression. While single gene studies revealed some important aspects of LUTI-based repression, how these features impact gene regulation at a global scale is unknown. By using transcript leader and direct RNA sequencing, here we identify 74 LUTI candidates that are expressed specifically during meiotic prophase. Translational repression of these candidates is ubiquitous and dependent on upstream open reading frames. However, LUTI-based transcriptional repression is highly variable. In only 50% of the cases, LUTI transcription causes downregulation of the protein-coding transcript isoform. Higher LUTI expression, enrichment of histone 3 lysine 36 trimethylation, and changes in nucleosome position are the strongest predictors of LUTI-based transcriptional repression. We conclude that LUTIs downregulate gene expression in a manner that integrates translational repression, chromatin state changes, and the magnitude of LUTI expression.

Abstract Pre-patterning of the embryo, driven by spatially localized factors, is a common feature across several non-mammalian species 1–4 . However, mammals display regulative development and thus it was thought that blastomeres of the embryo do not show such pre-patterning, contributing randomly to the three lineages of the blastocyst: the epiblast, primitive endoderm and trophectoderm that will generate the new organism, the yolk sac and placenta respectively 4–6 . Unexpectedly, early blastomeres of mouse and human embryos have been reported to have distinct developmental fates, potential and heterogeneous abundance of certain transcripts 7–12 . Nevertheless, the extent of the earliest intra-embryo differences remains unclear and controversial. Here, by utilizing multiplexed and label-free single-cell proteomics by mass-spectrometry 13 , we show that 2-cell mouse and human embryos contain an alpha and a beta blastomere as defined by differential abundance of hundreds of proteins exhibiting strong functional enrichment for protein synthesis, transport, and degradation. Such asymmetrically distributed proteins include Gps1 and Nedd8, depletion or overexpression of which in one blastomere of the 2-cell embryo impacts lineage segregation. These protein asymmetries increase at 4-cell stage. Intriguingly, halved mouse zygotes display asymmetric protein abundance that resembles alpha and beta blastomeres, suggesting differential proteome localization already within zygotes. We find that beta blastomeres give rise to a blastocyst with a higher proportion of epiblast cells than alpha blastomeres and that vegetal blastomeres, which are known to have a reduced developmental potential, are more likely to be alpha. Human 2-cell blastomeres also partition into two clusters sharing strong concordance with clusters found in mouse, in terms of differentially abundant proteins and functional enrichment. To our knowledge, this is the first demonstration of intra-zygotic and inter-blastomere proteomic asymmetry in mammals that has a role in lineage segregation.