The serotonin transporter, SERT, catalyzes serotonin reuptake at the synapse to terminate neurotransmission via an alternating access mechanism, and SERT inhibitors are the most widely prescribed antidepressants. Here, deep mutagenesis is used to determine the effects of nearly all amino acid substitutions on human SERT surface expression and transport of the fluorescent substrate APP+, identifying many mutations that enhance APP+ import. Comprehensive simulations of the entire ion-coupled import process reveal that while binding of the native substrate, serotonin, reduces free energy barriers between conformational states to promote SERT dynamics, the conformational free energy landscape in the presence of APP+ instead resembles Na+ bound-SERT, with a higher free energy barrier for transitioning to an inward-facing state. The deep mutational scan for SERT-catalyzed import of APP+ finds mutations that promote the necessary conformational changes that would otherwise be facilitated by the native substrate. Indeed, hundreds of gain-of-function mutations for APP+ import are found along the permeation pathway, most notably mutations that favor the formation of a solvent-exposed intracellular vestibule. The mutagenesis data support the simulated mechanism in which the neurotransmitter and a symported sodium share a common cytosolic exit pathway to achieve coupling. Furthermore, the mutational landscape for SERT surface expression, which likely filters out misfolded sequences, reveals that residues along the permeation pathway are mutationally tolerant, providing plausible evolutionary pathways for changes in transporter properties while maintaining folded structure.

Abstract A potential therapeutic candidate for neutralizing SARS-CoV-2 infection is engineering high-affinity soluble ACE2 decoy proteins to compete for binding of the viral spike (S) protein. Previously, a deep mutational scan of ACE2 was performed and has led to the identification of a triple mutant ACE2 variant, named ACE2 2 .v.2.4, that exhibits nanomolar affinity binding to the RBD domain of S. Using a recently developed transfer learning algorithm, TLmutation, we sought to identified other ACE2 variants, namely double mutants, that may exhibit similar binding affinity with decreased mutational load. Upon training a TLmutation model on the effects of single mutations, we identified several ACE2 double mutants that bind to RBD with tighter affinity as compared to the wild type, most notably, L79V;N90D that binds RBD with similar affinity to ACE2 2 .v.2.4. The successful experimental validation of the double mutants demonstrated the use transfer and supervised learning approaches for engineering protein-protein interactions and identifying high affinity ACE2 peptides for targeting SARS-CoV-2.

Vaccine hesitancy and continuing emergence of SARS-CoV-2 variants of concern that may escape vaccine-induced immune responses highlight the urgent need for effective COVID-19 therapeutics. Monoclonal antibodies used in the clinic have varying efficacies against distinct SARS-CoV-2 variants; thus, there is considerable interest in engineered ACE2 peptides with augmented binding affinities for SARS-CoV-2 Spike protein. These could have therapeutic benefit against multiple viral variants. Using molecular dynamics simulations, we show how three amino acid substitutions in an engineered soluble ACE2 peptide (sACE2 2 .v2.4-IgG1) markedly increase affinity for the SARS-CoV-2 Spike (S) protein. We demonstrate high binding affinity to S protein of the early SARS-CoV-2 WA-1/2020 isolate and also to multiple variants of concern: B.1.1.7 (Alpha), B.1.351 (Beta), P.1 (Gamma), and B.1.617.2 (Delta) SARS-CoV-2 variants. In humanized K18-hACE2 mice, prophylactic and therapeutic administration of sACE2 2 .v2.4-IgG1 peptide prevented acute lung vascular endothelial injury and lung edema (essential features of ARDS) and significantly improved survival after infection by SARS-CoV-2 WA-1/2020 as well as P.1 variant of concern. These studies demonstrate for the first time broad efficacy in vivo of an ACE2 decoy peptide against multiple SARS-CoV-2 variants and point to its therapeutic potential.

Abstract The reuptake of the neurotransmitter serotonin from the synaptic cleft by the serotonin transporter, SERT, is essential for proper neurological signaling. Biochemical studies have shown Thr276 of transmembrane helix 5 is a site of PKG-mediated SERT phosphorylation, which has been proposed to shifts the SERT conformational equlibira to promote inward-facing states, thus enhancing 5HT transport. Recent structural and simulation studies have provided insights into the conformation transitions during substrate transport but have not shed light on SERT regulation via post-translational modifications. Using molecular dynamics simulations and Markov state models, we investigate how Thr276 phosphorylation impacts the SERT mechanism and its role in enhancing transporter stability and function. Our simulations show that Thr276 phosphorylation alters the hydrogen-bonding network involving residues on transmembrane helix 5. This in turn decreases the free energy barriers for SERT to transition to the inward-facing state, thus facilitating 5HT transport. The results provide atomistic insights into in vivo SERT regulation and can be extended to other pharmacologically important transporters in the solute carrier superfamily.

Abstract Membrane transporters of the solute carrier 6 (SLC6) family mediate various physiological processes by facilitating the translocation of amino acids, neurotransmitters, and other metabolites. In the human body, these transporters are tightly controlled through various post-translational modifications with implications on protein expression, stability, membrane trafficking, and dynamics. While N-linked glycosylation is a universal regulatory mechanism among eukaryotes, the exact molecular mechanism of how glycosylation affects the SLC6 transporter family. It is generally believed that glycans influence transporter stability and membrane trafficking, however, the role of glycosylation on transporter dynamics remains inconsistent, with differing conclusions among individual transporters across the SLC6 family. In this study, we collected over 1 millisecond of aggregated all-atom molecular dynamics (MD) simulation data to identify the impact of N-glycans of four human SLC6 transporters: the serotonin transporter, dopamine transporter, glycine transporter, and neutral amino acid transporter B 0 AT1. We designed our computational study by first simulating all possible combination of a glycan attached to each glycosylation sites followed by investigating the effect of larger, oligo-N-linked glycans to each transporter. Our simulations reveal that glycosylation does not significantly affect transporter structure, but alters the dynamics of the glycosylated extracellular loop. The structural consequences of glycosylation on the loop dynamics are further emphasized in the presence of larger glycan molecules. However, no apparent trend in ligand stability or movement of gating helices was observed. In all, the simulations suggest that glycosylation does not consistently affect transporter structure and dynamics among the collective SLC6 family and should be characterized at a per-transporter level to further elucidate the underlining mechanisms of in vivo regulation.

Heterodimeric integrin proteins transmit signals through conformational changes upon ligand binding between their alpha (α) and beta (β) subunits. Early in chordate evolution, some α subunits acquired an "inserted" (I) domain, which expanded their ligand binding capacity but simultaneously obstructed the ancestral ligand-binding pocket. While this would seemingly impede conventional ligand-mediated integrin activation, it was proposed that the I domain itself could serve both as a ligand replacement and an activation trigger. Here, we provide compelling evidence in support of this longstanding hypothesis using high-resolution cryo-electron microscopy structures of two distinct integrin complexes: the ligand-free and E-cadherin-bound states of the αEβ7 integrin with the I domain, as well as the α4β7 integrin lacking the I domain in both a ligand-free state and bound to MadCAM-1. We trace the evolutionary origin of the I domain to an ancestral collagen-collagen interaction domain. Our analyses illuminate how the I domain intrinsically mimics an extrinsic ligand, enabling integrins to undergo the canonical allosteric cascade of conformational activation and dramatically expanding the range of cellular communication mechanisms in vertebrates.

Cyanobacteria are responsible for up to 80% of aquatic carbon dioxide fixation and have evolved specialized carbon concentrating mechanism to increase photosynthetic yield. As such, cyanobacteria are attractive targets for synthetic biology and engineering approaches to address the demands of global energy security, food production, and climate change for an increasing world's population. The bicarbonate transporter BicA is a sodium-dependent, low-affinity, high-flux bicarbonate symporter expressed in the plasma membrane of cyanobacteria. Despite extensive biochemical characterization of BicA, including the resolution of the BicA crystal structure, the dynamic understanding of the bicarbonate transport mechanism remains elusive. To this end, we have collected over 1 ms of all-atom molecular dynamics simulation data of the BicA dimer to elucidate the structural rearrangements involved in the substrate transport process. We further characterized the energetics of the cooperativity between BicA protomers and investigated potential mutations that are shown to decrease the free energy barrier of conformational transitions. In all, our study illuminates a detailed mechanistic understanding of the conformational dynamics of bicarbonate transporters and provide atomistic insights to engineering these transporters for enhanced photosynthetic production.

A reoccurring challenge in bioinformatics is predicting the phenotypic consequence of amino acid variation in proteins. Due to recent advances in sequencing techniques, sufficient genomic data is becoming available to train models that predict the evolutionary statistical energies for each sequence, but there is still inadequate experimental data to directly predict functional effects. One approach to overcome this data scarcity is to apply transfer learning and train more models with available datasets. In this study, we propose a set of transfer learning algorithms, we call TLmutation, which implements a supervised transfer learning algorithm that transfers knowledge from survival data to a protein function of interest in the same protein followed by an unsupervised transfer learning algorithm that extends the knowledge to a homologous protein. We explore the application of our algorithms in three cases. First, we test the supervised transfer on dozens of previously published mutagenesis datasets to complete and refine missing datapoints. We further investigate these datasets to identify which variants build better predictors of variant functions. In the second case, we apply the algorithm to predict higher-order mutations solely from single point mutagenesis data. Finally, we perform the unsupervised transfer learning algorithm to predict mutational effects of homologous proteins from experimental datasets. These algorithms are generalized to transfer knowledge between Markov random field models. We show the benefit of our transfer learning algorithms to utilize informative deep mutational data and provide new insights into protein variant functions. As these algorithms are generalized to transfer knowledge between Markov random field models, we expect these algorithms to be applicable to other disciplines.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.