Abstract Cancer-associated fibroblasts (CAF) are major players in the progression and drug resistance of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC). CAFs constitute a diverse cell population consisting of several recently described subtypes, although the extent of CAF heterogeneity has remained undefined. Here we use single-cell RNA sequencing to thoroughly characterize the neoplastic and tumor microenvironment content of human and mouse PDAC tumors. We corroborate the presence of myofibroblastic CAFs and inflammatory CAFs and define their unique gene signatures in vivo. Moreover, we describe a new population of CAFs that express MHC class II and CD74, but do not express classic costimulatory molecules. We term this cell population “antigen-presenting CAFs” and find that they activate CD4+ T cells in an antigen-specific fashion in a model system, confirming their putative immune-modulatory capacity. Our cross-species analysis paves the way for investigating distinct functions of CAF subtypes in PDAC immunity and progression. Significance: Appreciating the full spectrum of fibroblast heterogeneity in pancreatic ductal adenocarcinoma is crucial to developing therapies that specifically target tumor-promoting CAFs. This work identifies MHC class II–expressing CAFs with a capacity to present antigens to CD4+ T cells, and potentially to modulate the immune response in pancreatic tumors. See related commentary by Belle and DeNardo, p. 1001. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 983

This study reports the 15-year survivorship of 112 consecutive Total Condylar knee arthroplasties that have been followed since 1974. Two endpoints were chosen for survivorship: (1) Revision attributable to septic or aseptic loosening or malalignment. (2) Revision or roentgenographic evidence of component loosening. Life table analysis reveals a 94.1% clinical survivorship at 15 years, with an 90.9% survivorship when roentgenographic failures are included. There were five revisions: one for infection, one for instability, and three for tibial loosening. In addition, two tibiae and one patella were considered roentgenographically loose, but were not symptomatic. As of May 1992, 34 patients with 48 knees are known deceased, 15 knees are lost to follow-up evaluation, and 49 knees are available for clinical evaluation. Follow-up data was available on 62 knees for greater than 11 years. Ninety-two percent had good or excellent results, with 1.6% fair and 6.5% poor. Average range of motion was 99°. The average Hospital for Special Surgery knee score was 85. Roentgenographic study revealed lucencies around 72% of tibiae, but only two components were loose. There was a correlation between body weight and the presence of radiolucencies, and patients who weighed more than 80 kg had the lowest survivorship at 15 years: 89.2% clinical survival and 70.6% clinical plus roentgenographic survival. Total Condylar knee arthroplasty has a 94.6% clinical survival at 15 years, with predictably good clinical results.

Thirteen is the charm in anaphylaxis Immunoglobulin E (IgE) is a type of antibody associated with allergies and response to parasites such as worms. When high-affinity, allergen-specific IgE binds its target, it can cross-link receptors on mast cells that induce anaphylaxis. It remains unclear, however, how B cells are instructed to generate high-affinity IgE. Gowthaman et al. discovered a subset of T follicular helper cells (T FH 13) that direct B cells to do just that. T FH 13 cells are induced by allergens but not during parasite infection. Transgenic mice lacking these cells show impaired production of high-affinity, anaphylactic IgE. T FH 13 cells, which are elevated in patients with food and aeroallergies, may be targeted in future antianaphylaxis therapies. Science , this issue p. eaaw6433

Abstract Endometriosis is characterized by growth of endometrial-like tissue outside of the uterus affecting many women in their reproductive age, causing years of pelvic pain and potential infertility. Its pathophysiology remains largely unknown, limiting diagnosis and treatment. We characterized peritoneal and ovarian lesions at single-cell transcriptome resolution and compared to matched eutopic endometrium, control endometrium, and organoids derived from these tissues, generating data on over 100,000 cells across 12 individuals. We spatially localized many of the cell types using imaging mass cytometry. We identify a perivascular mural cell unique to the peritoneal lesions with dual roles in angiogenesis promotion and immune cell trafficking. We define an immunotolerant peritoneal niche, fundamental differences in eutopic endometrium and between lesions microenvironments, and a novel progenitor-like epithelial cell subpopulation. Altogether, this study provides a holistic view of the endometriosis microenvironment representing the first comprehensive cell atlas of the disease, essential information for advancing therapeutics and diagnostics.

SUMMARY The urinary bladder functions as a reservoir to store and extrude liquid bodily waste. Significant debate exists as to this tissue’s cellular composition and genes associated with their functions. We use a repertoire of cell profiling tools to comprehensively define and spatial resolve cell types. We characterize spatially validated, basal-to-luminal gene expression dynamics within the urothelium, the cellular source of most bladder cancers. We define three distinct populations of fibroblasts that spatially organize from the sub-urothelial layer through to the detrusor muscle, clarifying knowledge around these controversial interstitial cells, and associate increased fibroblasts with aging. We overcome challenges of profiling the detrusor muscle, absence from earlier single cell studies, to report on its transcriptome with many novel and neuronal-like features presumably associated with neuromuscular junctions. Our approach provides a blueprint for tissue atlas construction and the data provides the foundation for future studies of bladder function in health and disease.

ABSTRACT Background It is estimated by the American Cancer Society that approximately 5% of all metastatic tumors have no defined primary site (tissue) of origin and are classified as c ancers of u nknown p rimary (CUPs). The current standard of care for CUP patients depends on immunohistochemistry (IHC) based approaches to identify the primary site. The addition of post-mortem evaluation to IHC based tests helps to reveal the identity of the primary site for only 25% of the CUPs, emphasizing the acute need for better methods of determination of the site of origin. CUP patients are therefore given generic chemotherapeutic agents resulting in poor prognosis. When the tissue of origin is known, patients can be given site specific therapy with significant improvement in clinical outcome. Similarly, identifying the primary site of origin of metastatic cancer is of great importance for designing treatment. Identification of the primary site of origin is an import first step but may not be sufficient information for optimal treatment of the patient. Recent studies, primarily from The Cancer Genome Atlas (TCGA) project, and others, have revealed molecular subtypes in several cancer types with distinct clinical outcome. The molecular subtype captures the fundamental mechanisms driving the cancer and provides information that is essential for the optimal treatment of a cancer. Thus, along with primary site of origin, molecular subtype of a tumor is emerging as a criterion for personalized medicine and patient entry into clinical trials. However, there is no comprehensive toolset available for precise identification of tissue of origin or molecular subtype for precision medicine and translational research. Methods and Findings We posited that metastatic tumors will harbor the gene expression profiles of the primary site of origin of the cancer. Therefore, we decided to learn the molecular characteristics of the primary tumors using the large number of cancer genome profiles available from the TCGA project. Our predictors were trained for 33 cancer types and for the 11 cancers where there are established molecular subtypes. We estimated the accuracy of several machine learning models using cross-validation methods. The extensive testing using independent test sets revealed that the predictors had a median sensitivity and specificity of 97.2% and 99.9% respectively without losing classification of any tumor. Subtype classifiers achieved median sensitivity of 87.7% and specificity of 94.5% via cross validation and presented median sensitivity of 79.6% and specificity of 94.6% in two external datasets of 1,999 total samples. Importantly, these external data shows that our classifiers can robustly predict the primary site of origin from external microarray data, metastatic cancer data, and patient-derived xenograft (PDX) data. Conclusion We have demonstrated the utility of gene expression profiles to solve the important clinical challenge of identifying the primary site of origin and the molecular subtype of cancers based on machine learning algorithms. We show, for the first time to our knowledge, that our pan-cancer classifiers can predict multiple cancers’ primary site of origin from metastatic samples. The predictors will be made available as open source software, freely available for academic non-commercial use.

Long-term maintenance of spermatogenesis in mammals is supported by GDNF, an essential growth factor required for spermatogonial stem cell (SSC) self-renewal. Exploiting a transgenic GDNF overexpression model, which expands and normalizes the pool of undifferentiated spermatogonia between Plzf +/+ and Plzf lu/lu mice, we used RNAseq to identify a rare subpopulation of cells that express EOMES, a T-box transcription factor. Lineage tracing and busulfan challenge show that these are long-term SSCs that contribute to steady state spermatogenesis as well as regeneration following chemical injury. EOMES+ SSCs have a lower proliferation index than EOMES− GFRA1+ spermatogonia in wild-type but not in Plzf lu/lu mice. This comparison demonstrates that PLZF regulates their proliferative activity and suggests that EOMES+ SSCs are lost through proliferative exhaustion in Plzf lu/lu mice. Single cell RNA sequencing of EOMES+ cells from Plzf +/+ and Plzf lu/lu mice support a hierarchical model of both slow- and rapid-cycling SSCs.

ABSTRACT The ventral posterior hypothalamus (VPH) is an anatomically complex brain region implicated in arousal, reproduction, energy balance and memory processing. However, neuronal cell type diversity within the VPH is poorly understood, an impediment to deconstructing the roles of distinct VPH circuits in physiology and behavior. To address this question, we employed a droplet-based single cell RNA sequencing (scRNA-seq) approach to systematically classify molecularly distinct cell types in the mouse VPH. Analysis of >16,000 single cells revealed 20 neuronal and 18 non-neuronal cell populations, defined by suites of discriminatory markers. We validated differentially expressed genes in a selection of neuronal populations through fluorescence in situ hybridization (FISH). Focusing on the mammillary bodies (MB), we discovered transcriptionally-distinct clusters that exhibit a surprising degree of segregation within neuroanatomical subdivisions of the MB, while genetically-defined MB cell types project topographically to the anterior thalamus. This single cell transcriptomic atlas of cell types in the VPH provides a detailed resource for interrogating the circuit-level mechanisms underlying the diverse functions of VPH circuits in health and disease.

Background - Osteosarcoma (OS) is the most common malignant bone tumor in children. OS is characterized by a high degree of genomic instability, resulting in copy-number alterations and genomic rearrangements with no disease-defining recurrent mutations. Given the diverse genomic landscape of OS and the difficulty of identifying druggable therapeutic targets, use of immunotherapy techniques appears lucrative. However, clinical trials based on molecular characterization have failed to find new effective therapies, and outcomes have not improved over the last 40 years. Materials/Methods - We performed single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) using the 10x Genomics Chromium platform on six fresh tumor biopsy samples from pediatric OS patients. Raw data was processed using 10x CellRanger to produce transcript read counts for each cell. After filtering low-quality cells and doublet removal, counts were normalized using Seurat, and cells were integrated across samples with Harmony. Data was combined with a previously-published OS scRNA-seq cohort of six samples (GSE162454). Two additional OS samples were profiled using 10x Genomics Visium spatial transcriptomics for validation of discovered subtypes and to add spatial context. Results - Clustering identified 16 major cell types based on expression of canonical cell markers. Several immunosuppressive cell types were identified via subclustering of major cell types, including neutrophil myeloid-derived suppressor cells (MDSCs), regulatory and exhausted T-cells, and LAMP3+ dendritic cells. Markers for the cell types found in OS were identified for further validation using imaging techniques, including Visium spatial transcriptomics. We performed deconvolution using the scRNA-seq cell identities to examine colocalization of discovered cell types. Overall, the discovered clusters were common between patients, showing consistent cell type proportions. However, we found patient-specific differences in the frequency of some cell types, with one sample showing a higher proportion of T-cells along with increased presence of colocalized IFN-stimulated macrophages, and the other with a greater presence of neutrophils/MDSCs. Conclusions - Using single-cell transcriptomics, we were able to discover the presence of multiple immunosuppressive cell subtypes of neutrophils, T-cells, and dendritic cells. Additionally, spatial transcriptomics revealed multiple similar clusters between samples, and common colocalization of the discovered cell types within those clusters. However, differences in T-cell presence and interferon induction may be indicative of patient-specific immunogenicity in osteosarcoma tumors.

Identifying host genetic factors modulating immune checkpoint inhibitor (ICI) efficacy has been experimentally challenging because of variations in both host and tumor genomes, differences in the microbiome, and patient life exposures. Utilizing the Collaborative Cross (CC) multi-parent mouse genetic resource population, we developed an approach that fixes the tumor genomic configuration while varying host genetics. With this approach, we discovered that response to anti-PD-1 (aPD1) immunotherapy was significantly heritable in four distinct murine tumor models (