Abstract The spike (S) protein of SARS-CoV-2 has been observed in three distinct pre-fusion conformations: locked, closed and open. Of these, the function of the locked conformation remains poorly understood. Here we engineered a SARS-CoV-2 S protein construct “S-R/x3” to arrest SARS-CoV-2 spikes in the locked conformation by a disulfide bond. Using this construct we determined high-resolution structures confirming that the x3 disulfide bond has the ability to stabilize the otherwise transient locked conformations. Structural analyses reveal that wild-type SARS-CoV-2 spike can adopt two distinct locked-1 and locked-2 conformations. For the D614G spike, based on which all variants of concern were evolved, only the locked-2 conformation was observed. Analysis of the structures suggests that rigidified domain D in the locked conformations interacts with the hinge to domain C and thereby restrains RBD movement. Structural change in domain D correlates with spike conformational change. We propose that the locked-1 and locked-2 conformations of S are present in the acidic high-lipid cellular compartments during virus assembly and egress. In this model, release of the virion into the neutral pH extracellular space would favour transition to the closed or open conformations. The dynamics of this transition can be altered by mutations that modulate domain D structure, as is the case for the D614G mutation, leading to changes in viral fitness. The S-R/x3 construct provides a tool for the further structural and functional characterization of the locked conformations of S, as well as how sequence changes might alter S assembly and regulation of receptor binding domain dynamics.

Abstract Transcriptomic studies have reported numerous differentially expressed genes in colorectal carcinoma (CRC) versus noncancerous tissues. Given the large number of genes identified, it is unclear which ones are the key genes that drive cancer development. To address the issue, we conducted a large-scale study of eight cohorts with thousands of tumor and nontumor samples, analyzed transcriptomic data, and identified the most miniature set of differentially expressed genes (DEGs) that can nearly perfectly describe the overall features of CRC at the genomic level. The analytical framework was built on a recently proven powerful max-linear competing risk factor model. We first analyzed six public transcriptomic datasets and identified four critical DEGs (i.e., CXCL8, PSMC2, APP, and SLC20A1) with nearly perfect (close to 100%) predictive power. The findings were further validated in a newly collected Chinese cohort and another public dataset. Among the four DEGs, PSMC2 and CXCL8 appeared to play a central role, and CXCL8 alone could serve as a biomarker for early-stage CRC. They rise as druggable and vaccinable targets for CRC. This work represents a pioneering effort to identify critical colorectal-specific genes and their interactions that have not been discovered in previous endeavors. Simple Summary Human knowledge of cancer is still limited. There don’t exist reliable genomic biomarkers for cancer diagnosis, and truly functional and druggable genomic (gene) targets haven’t been reported. One of the main reasons is due to lack of powerful discovery tools to discover the best possible and accurate miniature set of genes to fight against the cancer war. Our research was motivated by such an urgent need, and we hope our findings can fill up gaps in the literature and medical practice. We focus on colorectal cancers in this paper.

Abstract In this study, a clear correlation between the in vitro and in vivo cellular uptake and trafficking was discovered by delivering miktoarm copolymer nanomicelles (MCNs) to cancer cells and tumor tissues. To monitor this process, two different FRET pairs, DiO and DiI, DiD and DiR, were loaded into MCNs to monitor the Förster resonance energy transfer (FRET) efficiency. The change in FRET efficiency in vitro and in vivo demonstrated a similar sequence of events for the transport of MCNs: hyperbranched block PCL inserted into cytomembrane, while the loaded hydrophobic fluorescence probes were released and followed by time-dependent intracellular clustering within endocytic vesicles. Additionally, uptake of loaded fluorescence probes with successively increasing ratios of copolymers suggested that with the increase of mass ratio of copolymer to fluorescence probes, cellular uptake of probes significantly decreased. This result was also consistent with the uptake behavior in cancer tissues. Collectively, the interaction between MCNs and cellular membrane dictated the uptake and trafficking of core-loaded hydrophobic probes. This concept paves a new way to analyze in vitro-in vivo correlation of other nanocarriers for endocytosis mechanism studies as well as further novel copolymers design in biomedical applications.

Abstract Purpose Neoadjuvant therapy (NAT) is increasingly being used for pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) treatment. However, its distinct effects on carcinoma cells and the tumor microenvironment (TME) are not fully understood. This study employs spatial transcriptomics and single-cell RNA sequencing to investigate how NAT differentially remodels PDAC’s carcinoma cells and TME. Experimental Design We used spatial transcriptomics to compare gene expression profiles in carcinoma cells and the TME between NAT-treated and NAT-naïve PDAC patients and correlated with their clinicopathologic features. Complementary single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) analysis was conducted to validate our findings and identify cell types driving NAT-induced gene expression alterations. Results We found NAT not only induces apoptosis and inhibits proliferation in carcinoma cells but also significantly remodels the TME. Notably, NAT induces a coordinated upregulation of multiple key complement genes (C3, C1S, C1R, C4B and C7) in the TME, making the complement pathway one of the most significantly affected pathways by NAT. Patients with higher TME complement expression following NAT exhibit improved overall survival; more immunomodulatory and neurotrophic cancer-associated fibroblasts (CAFs); more CD4 + T cells, monocytes and mast cells; and lower immune exhaustion gene expression. snRNA-seq analysis demonstrates C3 complement upregulation specifically in CAFs but not in other stroma cell types. Conclusions Our findings indicate that NAT may reduce immunosuppression in PDAC by enhancing complement production and signaling within the TME. These findings suggest that local complement dynamics could serve as a novel biomarker for prognosis, evaluating treatment response and resistance, and guiding therapeutic strategies in NAT-treated PDAC patients. Translational Relevance As neoadjuvant therapy (NAT) increasingly becomes the preferred approach in treating resectable and borderline resectable pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), there is a growing demand for novel biomarkers specifically tailored for post-NAT PDAC patients. Our study focused on how NAT differentially remodels the tumor cells and the tumor microenvironment (TME). We demonstrate that NAT can enhance local complement production and signaling in PDAC’s TME, which is associated with reduced immune exhaustion and improved overall survival. Our results highlight the importance of local complement dynamics in influencing treatment response, resistance, and overall clinical outcomes in PDAC. This new mechanism provides new opportunities in biomarker development which could facilitate more accurate prognostication and precise treatment stratification, particularly for patients undergoing NAT in PDAC.

Abstract The recent advances in single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) techniques have stimulated efforts to identify and characterize the cellular composition of complex tissues. With the advent of various sequencing techniques, automated cell-type annotation using a well-annotated scRNA-seq reference becomes popular but relies on the diversity of cell types in the reference. There are generally unseen cell types in the query data of interest because most data atlases are obtained for different purposes and techniques. When annotating new query data, identifying unseen cell types is fundamental not only for improving annotation accuracy but also for novel biological discoveries. Here, we propose mtANN (multiple-reference-based scRNA-seq data annotation), a new method to automatically annotate query data while accurately identifying unseen cell types with the aid of multiple references. Key innovations of mtANN include the integration of deep learning and ensemble learning to improve prediction accuracy, and the introduction of a new metric defined from three complementary aspects to distinguish between unseen cell types and shared cell types. In addition, a data-driven method is provided to adaptively select threshold for unseen cell-type identification. We demonstrate the advantages of mtANN over state-of-the-art methods for unseen cell-type identification and cell-type annotation on two benchmark dataset collections, as well as its predictive power on a collection of COVID-19 datasets. The source code and tutorial are available at https://github.com/Zhangxf-ccnu/mtANN . Author summary Single-cell transcriptomics is rapidly advancing our understanding of the cellular composition of complex tissues and organisms. With the advent of various sequencing techniques, automatic cell-type annotation using well-annotated single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) references has become popular. Compared with unsupervised cell-type annotation methods, it can be more easily applied to different data, saving labor and time costs. However, it relies on the diversity of cell types in the reference so there are generally unseen cell types in the query data. These unseen cell types need to be identified when annotating new sequencing data not only for improving annotation accuracy but also for novel biological discoveries. To address these issues, we propose mtANN, a new method to automatically annotate query data while accurately identify unseen cell types with the help of multiple references. We demonstrate the annotation performance of mtANN in PBMC and Pancreas collections when different proportions of unseen cell types are present in the query dataset. We also verify the practical application of mtANN in a collection of COVID-19 datasets for patients with different symptoms. When there are unseen cell types in the query dataset, mtANN is able to identify the unseen cell types and accurately annotate the shared cell types, especially the two cell types that are biologically similar.

Abstract Nanopore sequencing technology has revolutionized the field of genome biology with its ability to generate extra-long reads that can resolve regions of the genome that were previously inaccessible to short-read sequencing platforms. Although long-read sequencing has been used to resolve several vertebrate genomes, a nanopore-based zebrafish assembly has not yet been released. Over 50% of the zebrafish genome consists of difficult to map, highly repetitive, low complexity elements that pose inherent problems for short-read sequencers and assemblers. We used nanopore sequencing to improve upon and resolve the issues plaguing the current zebrafish reference assembly (GRCz11). Our long-read assembly improved the current resolution of the reference genome by identifying 1,697 novel insertions and deletions over 1Kb in length and placing 106 previously unlocalized scaffolds. We also discovered additional sites of retrotransposon integration previously unreported in GRCz11 and observed their expression in adult zebrafish under physiologic conditions, implying they have active mobility in the zebrafish genome and contribute to the ever-changing genomic landscape.