Healthy Research Rewards
ResearchHub is incentivizing healthy research behavior. At this time, first authors of open access papers are eligible for rewards. Visit the publications tab to view your eligible publications.
Got it
EC
Edwin Chapman
Author with expertise in Mechanisms of Intracellular Membrane Trafficking
Achievements
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
8
(88% Open Access)
Cited by:
5
h-index:
25
/
i10-index:
32
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
2

Polybasic patches in both C2 domains of Synaptotagmin-1 are required for evoked neurotransmitter release

Zhenyong Wu et al.Jul 6, 2021
ABSTRACT Synaptotagmin-1 (Syt1) is a vesicular calcium sensor required for synchronous neurotransmitter release. It is composed of a single-pass transmembrane domain linked to two tandem C2 domains (C2A and C2B) that bind calcium, acidic lipids, and SNARE proteins that drive fusion of the synaptic vesicle with the plasma membrane. Despite its essential role, how Syt1 couples calcium entry to synchronous release is not well understood. Calcium binding to C2B, but not to C2A, is critical for synchronous release and C2B additionally binds the SNARE complex. The C2A domain is also required for Syt1 function, but it is not clear why. Here we asked what critical feature of C2A may be responsible for its functional role, and compared this to the analogous feature in C2B. We focused on highly conserved poly-lysine patches located on the sides of C2A (K189-192) and C2B (K324-327). We tested effects of charge-neutralization mutations in either region (Syt1 K189-192A and Syt1 K326-327A ) side-by-side to determine their relative contributions to Syt1 function in cultured cortical mouse neurons and in single-molecule experiments. Combining electrophysiological recordings and optical tweezers measurements to probe dynamic single C2 domain-membrane interactions, we show that both C2A and C2B polybasic patches contribute to membrane binding, and both are required for evoked release. The readily releasable vesicle pool or spontaneous release were not affected, so both patches are specifically required for synchronization of release. We suggest these patches contribute to cooperative binding to membranes, increasing the overall affinity of Syt1 for negatively charged membranes and facilitating evoked release. Significance Statement Synaptotagmin-1 is a vesicular calcium sensor required for synchronous neurotransmitter release. Its tandem cytosolic C2 domains (C2A and C2B) bind calcium, acidic lipids, and SNARE proteins that drive fusion of the synaptic vesicle with the plasma membrane. How calcium-binding to Synaptotagmin-1 leads to release and the relative contributions of the two C2 domains is not clear: unlike C2B, calcium-binding to C2A is not critical for evoked release, yet both domains are needed for Syt1 function. Combining electrophysiological recordings from cultured neurons and optical tweezers measurements that probe single C2 domain-membrane interactions, we show that conserved polybasic regions in both domains contribute to membrane binding cooperatively, and both are required for evoked release, likely by increasing the overall affinity of Synaptotagmin-1 for negatively charged membranes.
2
Citation3
0
Save
3

Digital nanoreactors for control over absolute stoichiometry and spatiotemporal behavior of receptors within lipid bilayers

Vishal Maingi et al.Oct 7, 2022
Interactions between membrane proteins are essential for cell survival and proper function, but the structural and mechanistic details of these interactions are often poorly understood. Even the biologically functional ratio of protein components within a multi-subunit membrane complex—the native stoichiometry—is difficult to establish. We have demonstrated digital nanoreactors that can control interactions between lipid-bound molecular receptors along three key dimensions: stoichiometric, spatial, and temporal. Each nanoreactor is based on a DNA origami ring, which both templates the synthesis of a liposome and provides tethering sites for DNA-based receptors. Receptors are released into the liposomal membrane using strand displacement and a DNA logic gate measures receptor heterodimer formation. High-efficiency tethering of receptors enables the kinetics of receptors in 1:1 and 2:2 absolute stoichiometries to be observed by bulk fluorescence in a plate reader which in principle is generalizable to any ratio. Similar â€˜single molecule in bulk’ experiments using DNA-linked membrane proteins could determine native stoichiometry and the kinetics of membrane protein interactions for applications ranging from signalling research to drug discovery.
3
Citation1
0
Save
3

Synaptotagmin 1 oligomerization via the juxtamembrane linker regulates spontaneous and evoked neurotransmitter release

Kevin Courtney et al.Jul 29, 2021
ABSTRACT Synaptotagmin-1 (syt1) is a Ca 2+ sensor that regulates synaptic vesicle exocytosis. Cell-based experiments suggest that syt1 functions as a multimer, however biochemical and electron microscopy studies have yielded contradictory findings regarding putative self-association. Here, we performed dynamic light scattering on syt1 in solution, followed by electron microscopy, and used atomic force microscopy to study syt1 self-association on supported lipid bilayers under aqueous conditions. Ring-like multimers were clearly observed. Multimerization was enhanced by Ca 2+ and required anionic phospholipids. Large ring-like structures (∼180 nm) were reduced to smaller rings (∼30 nm) upon neutralization of a cluster of juxtamembrane lysine residues; further substitution of residues in the second C2-domain completely abolished self-association. When expressed in neurons, syt1 mutants with graded reductions in self-association activity exhibited concomitant reductions in: a) clamping spontaneous release, and b) triggering and synchronizing evoked release. Thus, the juxtamembrane linker of syt1 plays a crucial role in exocytosis by mediating multimerization.
3
Citation1
0
Save
7

Synaptotagmin-9 and Tomosyn-1 molecular complex regulates Stx1A SNAREs to inhibit insulin secretion from pancreatic Î²-cells

Md Rahman et al.Oct 21, 2022
Summary Stimulus-coupled insulin secretion from Î²-cells involves the fusion of insulin granules to the plasma membrane (PM) via SNARE complex formation—a cellular process key for maintaining whole-body glucose homeostasis. Optimal insulin secretion depends on how the clamping of SNAREs is released, rendering granules fusogenic. We show that an insulin granule protein synaptotagmin-9 (Syt9) deletion in lean mice increased glucose clearance, random-fed plasma insulin levels, and insulin secretion (in vivo and ex vivo islets) without affecting insulin sensitivity. These outcomes demonstrate that Syt9 has an inhibitory function in insulin secretion. Moreover, Syt9 interacts with PM-Stx1A and soluble Tomosyn-1 proteins to form non-fusogenic complexes between PM and insulin granules, preventing Stx1A-SNARE formation and insulin secretion. Furthermore, Syt9 inhibits SNARE-complex formation by posttranscriptional regulation of Tomosyn-1. We conclude that Syt9 and Tomosyn-1 are endogenous inhibitors that modulate Stx1A availability to determine Î²-cell secretory capacity. Highlights Synaptotagmin-9 inhibits biphasic insulin secretion from Î²-cells. Synaptotagmin-9, syntaxin-1A, and Tomosyn-1 forms a molecular complex that decreases the availability of syntaxin-1A to form SNARE complexes in insulin secretion. Synaptotagmin-9–mediated inhibition of insulin secretion occurs through post-transcriptional regulation of Tomosyn-1.
1

VAMP2 AND SYNAPTOTAGMINS ARE RELATIVELY IMMOBILE ON CHROMAFFIN GRANULE MEMBRANES: IMPLICATIONS FOR MEMBRANE FUSION AND FUSION PORE EXPANSION

Prabhodh Abbineni et al.Feb 20, 2021
Abstract Although many of the proteins of secretory granules have been identified, little is known about their molecular organization and diffusion characteristics. Granule-plasma membrane fusion can only occur when proteins that enable fusion are present at the granule-plasma membrane contact. Thus, the mobility of granule membrane proteins may be an important determinant of fusion pore formation and expansion. To address this issue, we measured the mobility of (fluorophore-tagged) vesicle associated membrane protein 2 (VAMP2), synaptotagmin 1 (Syt1), and synaptotagmin 7 (Syt7) in chromaffin granule membranes in living chromaffin cells. We used a method that is not limited by standard optical resolution. A bright flash of strongly decaying evanescent field (∼80 nm exponential decay constant) produced by total internal reflection (TIR) was used to photobleach GFP-labeled proteins in the granule membrane. Fluorescence recovery occurs as unbleached protein in the granule membrane distal from the glass interface diffuses into the more bleached proximal regions, thereby enabling the measurement of diffusion coefficients. The studies revealed that VAMP2, Syt1, and Syt7 are relatively immobile in chromaffin granules membranes with diffusion constants of â‰¤ 3 Ã— 10 âˆ’10 cm 2 /s. Utilizing these diffusion parameters and the known density of VAMP2 and Syt 1 on synaptic vesicles, we estimated the time required for these proteins to arrive at a nascent fusion site to be tens of milliseconds. We propose that the mobilities of secretory granule SNARE and Syt proteins, heretofore unappreciated factors, influence the kinetics of exocytosis and protein discharge. Significance Statement In eukaryotic cells, secretory vesicles fuse with the plasma membrane to secrete chemical transmitters, hormones and proteins that enable diverse physiological functions including neurotransmission. Fusion proteins need to be assembled at the fusion site in sufficient number in order to enable membrane fusion. However, the diffusion characteristics of fusogenic proteins on secretory vesicles remained unknown. Here we used a novel method not limited by standard optical resolution to measure the diffusion of VAMP2 and synaptotagmins on chromaffin granule membranes. We found they have limited mobility. The time required for these proteins to reach the granule-plasma membrane contact site suggests that their limited mobility likely influences the kinetics of membrane fusion and subsequent fusion pore expansion.
1

Label-free observation of individual solution phase molecules

Lisa-Maria Needham et al.Mar 25, 2023
The vast majority of chemistry and biology occurs in solution, and new label-free analytical techniques that can help resolve solution-phase complexity at the single-molecule level can provide new microscopic perspectives of unprecedented detail. Here, we use the increased light-molecule interactions in high-finesse fiber Fabry-Pérot microcavities to detect individual biomolecules as small as 1.2 kDa with signal-to-noise ratios >100, even as the molecules are freely diffusing in solution. Our method delivers 2D intensity and temporal profiles, enabling the distinction of sub-populations in mixed samples. Strikingly, we observe a linear relationship between passage time and molecular radius, unlocking the potential to gather crucial information about diffusion and solution-phase conformation. Furthermore, mixtures of biomolecule isomers of the same molecular weight can also be resolved. Detection is based on a novel molecular velocity filtering and dynamic thermal priming mechanism leveraging both photo-thermal bistability and Pound-Drever-Hall cavity locking. This technology holds broad potential for applications in life and chemical sciences and represents a major advancement in label-free in vitro single-molecule techniques.
18

Membrane compression by synaptic vesicle exocytosis triggers ultrafast endocytosis

Haoyuan Jing et al.Jun 12, 2022
Abstract Compensatory endocytosis keeps the surface area of secretory cells constant following exocytosis. At chemical synapses, clathrin-independent ultrafast endocytosis maintains such homeostasis. This endocytic pathway is temporally and spatially coupled to exocytosis, initiating within 50 ms at the region immediately next to where vesicles fuse: the active zone. How synaptic vesicle exocytosis induces ultrafast endocytosis is unknown. Here, we demonstrate that actin filaments are enriched in the region surrounding active zone at mouse hippocampal synapses and that the membrane area conservation due to this actin corral is necessary for exo-endocytic coupling. Simulations suggest that flattening of fused vesicles exerts lateral membrane pressure in the plasma membrane against the actin corral, resulting in rapid formation of endocytic pits at the border between the active zone and the surrounding actin-enriched region. Consistent with our simulations, ultrafast endocytosis does not initiate when actin organization is disrupted, either pharmacologically or by ablation of the actin-binding protein Epsin1. These data suggest that endocytosis is mechanically coupled to exocytosis at synapses.