Abstract The complete sequence of the Arabidopsis thaliana genome revealed thousands of previously unsuspected genes, many of which cannot be ascribed even putative functions. One of the largest and most enigmatic gene families discovered in this way is characterized by tandem arrays of pentatricopeptide repeats (PPRs). We describe a detailed bioinformatic analysis of 441 members of the Arabidopsis PPR family plus genomic and genetic data on the expression (microarray data), localization (green fluorescent protein and red fluorescent protein fusions), and general function (insertion mutants and RNA binding assays) of many family members. The basic picture that arises from these studies is that PPR proteins play constitutive, often essential roles in mitochondria and chloroplasts, probably via binding to organellar transcripts. These results confirm, but massively extend, the very sparse observations previously obtained from detailed characterization of individual mutants in other organisms.

Abstract Probably more than 25% of the proteins encoded by the nuclear genomes of multicellular eukaryotes are targeted to membrane‐bound compartments by N ‐terminal targeting signals. The major signals are those for the endoplasmic reticulum, the mitochondria, and in plants, plastids. The most abundant of these targeted proteins are well‐known and well‐studied, but a large proportion remain unknown, including most of those involved in regulation of organellar gene expression or regulation of biochemical pathways. The discovery and characterization of these proteins by biochemical means will be long and difficult. An alternative method is to identify candidate organellar proteins via their characteristic N ‐terminal targeting sequences. We have developed a neural network‐based approach (Predotar – Prediction of Organelle Targeting sequences) for identifying genes encoding these proteins amongst eukaryotic genome sequences. The power of this approach for identifying and annotating novel gene families has been illustrated by the discovery of the pentatricopeptide repeat family.

Genome sequencing projects in eukaryotes are revealing thousands of new genes of unknown function, many of which fall into gene families. We discovered one such family while systematically screening predicted Arabidopsis proteins for those likely to be targeted to mitochondria or chloroplasts. This large gene family (almost 200 genes in the 70% of the Arabidopsis genome sequenced so far) is characterized by the presence of tandem arrays of a degenerate 35-amino-acid repeat (Fig. 1). The same family has been identified independently on the basis of other criteria by Aubourg et al.1 Aubourg S. et al. In Arabidopsis thaliana, 1% of the genome is coding for a novel protein family unique to plants. Plant Mol. Biol. 2000; (in press) Google Scholar Two-thirds of these Arabidopsis proteins are predicted to be targeted to either mitochondria or chloroplasts (N. Peeters and I.D. Small, unpublished). None of them have been characterized in any way to our knowledge, but a few related sequences in other organisms have been studied. The maize gene crp1 ( 2 Fisk D.G. et al. Molecular cloning of the maize gene crp1 reveals similarity between regulators of mitochondrial and chloroplast gene expression. EMBO J. 1999; 18: 2621-2630 Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar ) is a member of the same family, and similar repeats are found in PET309 from Saccharomyces cerevisiae3 Manthey G.M. McEwen J.E. The product of the nuclear gene PET309 is required for translation of mature mRNA and stability or production of intron-containing RNAs derived from the mitochondrial COXI locus of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 1995; 14: 4031-4043 PubMed Google Scholar and cya-5 from Neurospora crassa4 Coffin J.W. et al. The Neurospora crassa cya-5 nuclear gene encodes a protein with a region of homology to the Saccharomyces cerevisiae PET309 protein and is required in a post-transcriptional step for the expression of the mitochondrially encoded COXI protein. Curr. Genet. 1997; 32: 273-280 Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar . All three genes encode proteins involved in some way in processing or translation, or both, of particular organellar mRNAs ( 2 Fisk D.G. et al. Molecular cloning of the maize gene crp1 reveals similarity between regulators of mitochondrial and chloroplast gene expression. EMBO J. 1999; 18: 2621-2630 Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar ). None of these three proteins show obvious sequence similarity to each other or to the Arabidopsis proteins outside the zone of repeats. The repeat structure in these proteins appears to have been initially overlooked, although Fisk et al. 2 Fisk D.G. et al. Molecular cloning of the maize gene crp1 reveals similarity between regulators of mitochondrial and chloroplast gene expression. EMBO J. 1999; 18: 2621-2630 Crossref PubMed Scopus (211) Google Scholar state in a note added in proof that these proteins contain TPR (tetratricopeptide) motifs. In fact, although the 35-amino-acid repeats do resemble TPR motifs, they have significant and characteristic differences. To distinguish them from TPR motifs, we propose to call them PPR (pentatricopeptide) motifs. Using BLAST ( 5 Altschul S.F. et al. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 1990; 215: 403-410 Crossref PubMed Scopus (72097) Google Scholar ) searches on the non-redundant GenBank peptide database, we built up a list of more than 100 sequences likely to contain PPR motifs and then used the MEME program 6 Bailey, T.L. and Elkan, C. (1994) Fitting a Mixture Model by Expectation Maximization to Discover Motifs in Biopolymers. In Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology, pp. 28–36, AAAI Press Google Scholar on this set of sequences to define a profile corresponding to the PPR motif (Fig. 1). This profile was then used by MOTIFSEARCH [part of the Genetics Computer Group (GCG) Wisconsin Package, Version 10.0, Madison, WI, USA] to screen the SwissProt/TrEMBL, PIR and GenPept databases. A total of 213 sequences were found with a combined probability score of less than 10−4 and containing at least one pair of motifs in tandem (the latter criterion being a very stringent requirement). The number of motifs per peptide ranges from 2 to 26, with a mean of 9.1. CRP1, Pet309p and CYA-5 were found in this search, along with a few other human or yeast proteins of unknown function (Table 1) and a salt-inducible protein from tobacco 8 Chang P-F. Alterations in cell membrane structure and expression of a membrane-associated protein after adaptation to osmotic stress. Physiol. Plant. 1996; 98: 505-516 Crossref Scopus (24) Google Scholar . The vast majority of the other sequences are from Arabidopsis. There are numerous expressed sequence tags (ESTs) from related genes from several plant species, including rice, so this gene family is likely to be widespread in higher plants (EST-encoded peptides were not included in the set searched with MOTIFSEARCH). No prokaryotic proteins were found to possess tandem copies of this motif and none of the known TPR-containing proteins were revealed via this search. Table 1Non-plant proteins containing putative PPR motifs Species a Abbreviations: H. sapiens, Homo sapiens; N. crassa, Neurospora crassa; S. cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae; S. pombe, Schizosaccharomyces pombe. Accession no. Name Minimum no. of PPR motifs b PPR motifs were detected using the MEME profile. The proteins could contain other, less conserved copies of the PPR motif. The longest stretch of strictly tandem repeats is indicated in parentheses. Subcellular localization Function H. sapiens AAA67550 GP130 10 (3) Not mitochondrial c Subcellular localizations are MitoProt predictions7. ? S. cerevisiae P32522 PET309 6 (3) Mitochondrial RNA processing/translation S. pombe TrEMBL:O14275 C8C9.06C 6 (2) Mitochondrial c Subcellular localizations are MitoProt predictions7. ? H. sapiens TrEMBL:O75127 KIAA0632 5 (2) ? (partial sequence) ? N. crassa TrEMBL:P87224 CYA5 5 (2) Mitochondrial RNA processing/translation S. pombe TrEMBL:O42955 C19G7.07C 4 (2) Mitochondrial c Subcellular localizations are MitoProt predictions7. ? S. pombe TrEMBL:O94368 C1604.02C 3 (2) Mitochondrial c Subcellular localizations are MitoProt predictions7. ? S. cerevisiae P48237 YGL150c 3 (1) Mitochondrial c Subcellular localizations are MitoProt predictions7. ? S. cerevisiae S52526 YPLOO5w 3 (1) Mitochondrial c Subcellular localizations are MitoProt predictions7. ? a Abbreviations: H. sapiens, Homo sapiens; N. crassa, Neurospora crassa; S. cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae; S. pombe, Schizosaccharomyces pombe. b PPR motifs were detected using the MEME profile. The proteins could contain other, less conserved copies of the PPR motif. The longest stretch of strictly tandem repeats is indicated in parentheses. c Subcellular localizations are MitoProt predictions 7 Claros M.G. Vincens P. Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur. J. Biochem. 1996; 241: 770-786 Crossref Scopus (1388) Google Scholar . Open table in a new tab

RRS1-R confers broad-spectrum resistance to several strains of the causal agent of bacterial wilt, Ralstonia solanacearum. Although genetically defined as recessive, this R gene encodes a protein whose structure combines the TIR-NBS-LRR domains found in several R proteins and a WRKY motif characteristic of some plant transcriptional factors and behaves as a dominant gene in transgenic susceptible plants. Here we show that PopP2, a R. solanacearum type III effector, which belongs to the YopJ/AvrRxv protein family, is the avirulence protein recognized by RRS1-R. Furthermore, an interaction between PopP2 and both RRS1-R and RRS1-S, present in the resistant Nd-1 and susceptible Col-5 Arabidopsis thaliana ecotypes, respectively, was detected by using the yeast split-ubiquitin two-hybrid system. This interaction, which required the full-length R protein, was not observed between the RRS1 proteins and PopP1, another member of the YopJ/AvrRxv family present in strain GMI1000 and that confers avirulence in Petunia. We further demonstrate that both the Avr protein and the RRS1 proteins colocalize in the nucleus and that the nuclear localization of the RRS1 proteins are dependent on the presence of PopP2.

Ralstonia solanacearum is a soil-borne beta-proteobacterium that causes bacterial wilt disease in many food crops and is a major problem for agriculture in intertropical regions. R. solanacearum is a heterogeneous species, both phenotypically and genetically, and is considered as a species complex. Pathogenicity of R. solanacearum relies on the Type III secretion system that injects Type III effector (T3E) proteins into plant cells. T3E collectively perturb host cell processes and modulate plant immunity to enable bacterial infection. We provide the catalogue of T3E in the R. solanacearum species complex, as well as candidates in newly sequenced strains. 94 T3E orthologous groups were defined on phylogenetic bases and ordered using a uniform nomenclature. This curated T3E catalog is available on a public website and a bioinformatic pipeline has been designed to rapidly predict T3E genes in newly sequenced strains. Systematical analyses were performed to detect lateral T3E gene transfer events and identify T3E genes under positive selection. Our analyses also pinpoint the RipF translocon proteins as major discriminating determinants among the phylogenetic lineages. Establishment of T3E repertoires in strains representatives of the R. solanacearum biodiversity allowed determining a set of 22 T3E present in all the strains but provided no clues on host specificity determinants. The definition of a standardized nomenclature and the optimization of predictive tools will pave the way to understanding how variation of these repertoires is correlated to the diversification of this species complex and how they contribute to the different strain pathotypes.

SUMMARY Plant resistance genes (or NLR “Nod-like Receptors”) are known to contain atypical domains procuring them with a decoy capacity. Some of these integrated domains (or ID) allow the plant to lure the virulence determinants (“effectors”) of pathogens and triggering a specific NLR immune reaction. In this work, our goal was to generate a library of known IDs that could be screened with plant pathogen effectors in order to identify putative new effector virulence targets and NLR-effector pairs. We curated the IDs contained in NLRs from seven model and crop plant species. We cloned 52 IDs representing 31 distinct Pfam domains. This library was screened for interaction by yeast-two-hybrid with a set of 31 conserved Ralstonia solanacearum type III effectors. This screening and the further in planta interaction assay allowed us to identify three interactions, involving different IDs (kinase, DUF3542, WRKY) and two type III effectors (RipAE and PopP2). PopP2 was found to physically interact with ID#85, an atypical WRKY domain integrated in the GmNLR-ID85 NLR protein from Soybean. Using a imaging method in living plant cells, we showed that PopP2 associates with ID#85 in the nucleus. But unlike the known WRKY-containing Arabidopsis RRS1-R NLR receptor, this newly identified soybean WRKY domain could not be acetylated by PopP2 and its atypical sequence (WRKYGKR) also probably renders it inefficient in plant immunity triggering. This ID toolkit is available for screening with other plant pathogen effectors and should prove useful to discover new effectors targets and potentially engineer new plant resistance genes.

The soil is known to be a very microbe-rich environement. Plant roots are surrounded by a complex microbiota among which, in warm climates, the pathogenic bacteria belonging to the Ralstonia sp. species complex. We used a combination of mathematical modelling and experimental plant infection methods, mimicking the natural conditions, to define the key parameters describing the infection, colonization and wilting of the host plant (bacterial wilt disease). Importantly, our model takes into account the possibility for the orthologous re-infection of already infected plants. We showed that it is the case in our experimental setup and likely to also happen in natura. We were able to model and experimentaly measure the plant infection bottleneck, under these non-forced infection conditions. We then quantified to what extend the plant natural barriers can restrict (up to 50 times) this bottleneck size. We also measured the importance of the bacterial main virulence determinants (type III effectors) to allowing infection, as there is a reduction of the bottleneck by 70 times when the type III arsenal is absent. We further validated the model by predicting a strain caracteristics using only a few experimentally determined parameters. Finally the analysis of the global colonization dynamics allowed an accurate assessment of the in planta bacterial load triggering disease.

Race 1 strains of Pseudomonas syringae pv. tomato, which causes bacterial speck disease of tomato, are becoming increasingly common and no simply-inherited genetic resistance to such strains is known. We discovered that a locus in Solanum lycopersicoides, termed Pseudomonas tomato race 1 (Ptr1), confers resistance to race 1 Pst strains by recognizing the type III effector AvrRpt2. In Arabidopsis, AvrRpt2 degrades the RIN4 protein thereby activating RPS2-mediated immunity. Ptr1 also recognized homologs of AvrRpt2 from diverse bacteria including one in Ralstonia pseudosolanacearum and this correlated with the ability of AvrRpt2 to degrade RIN4. Using site-directed mutagenesis of AvrRpt2 we found that Ptr1 and RPS2 recognize identical features of AvrRpt2. However, the genome sequence of S. lycopersicoides revealed no RPS2 homolog in the Ptr1 region. Ptr1 could play an important role in controlling bacterial speck disease and its future cloning may shed light on an example of convergent evolution for recognition of a widespread type III effector.

Plant growth response to Arbuscular Mycorrhizal (AM) fungi is variable and depends on genetic and environment factors that still remain largely unknown. Identification of these factors can be envisaged using high-throughput and accurate plant phenotyping. We setup experimental conditions based on a two-compartment system allowing to measure Brachypodium distachyon mycorhizal growth response (MGR) in an automated phenotyping greenhouse. We developed a new image analysis software -IPSO Phen- to estimate of B. distachyon aboveground biomass. We found a positive MGR in the B. distachyon Bd3-1 genotype inoculated with the AM fungi Rhizophagus irregularis only if nitrogen and phosphorus were added together in the compartment restricted to AM fungi. Using this condition, we found genetic diversity in B. distachyon for MGR ranging from positive to negative MGR depending on the plant genotype tested. Our result on the interaction between nitrogen and phosphorus for MGR in B. distachyon opens new perspectives about AM functioning. In addition, our open-source software allowing to test and run image analysis parameters on large amount of images generated by automated plant phenotyping facilities, will help to screen large panels of genotypes and environmental conditions to identify the factors controlling the MGR.

Interfamily transfer of plant pattern recognition receptors (PRRs) represents a promising biotechnological approach to engineer broad-spectrum, and potentially durable, disease resistance in crops. It is however unclear whether new recognition specificities to given pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) affect the interaction of the recipient plant with beneficial microbes. To test this in a direct reductionist approach, we transferred the Brassicaceae-specific PRR ELONGATION FACTOR-THERMO UNSTABLE RECEPTOR (EFR) from Arabidopsis thaliana to the legume Medicago truncatula, conferring recognition of the bacterial EF-Tu protein. Constitutive EFR expression led to EFR accumulation and activation of immune responses upon treatment with the EF-Tu-derived elf18 peptide in leaves and roots. The interaction of M. truncatula with the bacterial symbiont Sinorhizobium meliloti is characterized by the formation of root nodules that fix atmospheric nitrogen. Although nodule numbers were slightly reduced at an early stage of the infection in EFR-Medicago when compared to control lines, nodulation was similar in all lines at later stages. Furthermore, nodule colonization by rhizobia, and nitrogen fixation were not compromised by EFR expression. Importantly, the M. truncatula lines expressing EFR were substantially more resistant to the root bacterial pathogen Ralstonia solanacearum. Our data suggest that the transfer of EFR to M. truncatula does not impede root nodule symbiosis, but has a positive impact on disease resistance against a bacterial pathogen. In addition, our results indicate that Rhizobium can either avoid PAMP recognition during the infection process, or is able to actively suppress immune signaling.