Deep-genome and single-cell sequencing analyses of patient-derived breast cancer xenografts reveal extensive, dynamic and reproducible changes in intra-tumoral mutational clonal composition on engraftment and serial propagation. Xenograft transplantation of primary human cancer cells into mice provides valuable models in which to study mechanisms underlying tumorigenesis, drug response and resistance. This study demonstrates that clonal evolution resembling that seen in human tumours also occurs on engraftment and during subsequent passaging of breast tumours in immunodeficient mice. In addition, similar clonal expansion patterns emerge in independent grafts of the same starting tumour population, indicating that genomic aberrations can be reproducible determinants of evolutionary trajectories. These findings suggest that patient-derived xenografts may be useful for studying patient-specific tumour characteristics such as the response to drugs tailored to specific genomic alterations. Human cancers, including breast cancers, comprise clones differing in mutation content. Clones evolve dynamically in space and time following principles of Darwinian evolution1,2, underpinning important emergent features such as drug resistance and metastasis3,4,5,6,7. Human breast cancer xenoengraftment is used as a means of capturing and studying tumour biology, and breast tumour xenografts are generally assumed to be reasonable models of the originating tumours8,9,10. However, the consequences and reproducibility of engraftment and propagation on the genomic clonal architecture of tumours have not been systematically examined at single-cell resolution. Here we show, using deep-genome and single-cell sequencing methods, the clonal dynamics of initial engraftment and subsequent serial propagation of primary and metastatic human breast cancers in immunodeficient mice. In all 15 cases examined, clonal selection on engraftment was observed in both primary and metastatic breast tumours, varying in degree from extreme selective engraftment of minor (<5% of starting population) clones to moderate, polyclonal engraftment. Furthermore, ongoing clonal dynamics during serial passaging is a feature of tumours experiencing modest initial selection. Through single-cell sequencing, we show that major mutation clusters estimated from tumour population sequencing relate predictably to the most abundant clonal genotypes, even in clonally complex and rapidly evolving cases. Finally, we show that similar clonal expansion patterns can emerge in independent grafts of the same starting tumour population, indicating that genomic aberrations can be reproducible determinants of evolutionary trajectories. Our results show that measurement of genomically defined clonal population dynamics will be highly informative for functional studies using patient-derived breast cancer xenoengraftment.

The inter- and intra-tumor heterogeneity of breast cancer needs to be adequately captured in pre-clinical models. We have created a large collection of breast cancer patient-derived tumor xenografts (PDTXs), in which the morphological and molecular characteristics of the originating tumor are preserved through passaging in the mouse. An integrated platform combining in vivo maintenance of these PDTXs along with short-term cultures of PDTX-derived tumor cells (PDTCs) was optimized. Remarkably, the intra-tumor genomic clonal architecture present in the originating breast cancers was mostly preserved upon serial passaging in xenografts and in short-term cultured PDTCs. We assessed drug responses in PDTCs on a high-throughput platform and validated several ex vivo responses in vivo. The biobank represents a powerful resource for pre-clinical breast cancer pharmacogenomic studies (http://caldaslab.cruk.cam.ac.uk/bcape), including identification of biomarkers of response or resistance.

Abstract Introduction The organisation of the mammary epithelial hierarchy is poorly understood. Our hypothesis is that the luminal cell compartment is more complex than initially described, and that an understanding of the developmental relationships within this lineage will help in understanding the cellular context in which breast tumours occur. Methods We used fluorescence-activated cell sorting along with in vitro and in vivo functional assays to examine the growth and differentiation properties of distinct subsets of human and mouse mammary epithelial cells. We also examined how loss of steroid hormones influenced these populations in vivo . Gene expression profiles were also obtained for all the purified cell populations and correlated to those obtained from breast tumours. Results The luminal cell compartment of the mouse mammary gland can be resolved into nonclonogenic oestrogen receptor-positive (ER + ) luminal cells, ER + luminal progenitors and oestrogen receptor-negative (ER - ) luminal progenitors. The ER + luminal progenitors are unique in regard to cell survival, as they are relatively insensitive to loss of oestrogen and progesterone when compared with the other types of mammary epithelial cells. Analysis of normal human breast tissue reveals a similar hierarchical organisation composed of nonclonogenic luminal cells, and relatively differentiated (EpCAM + CD49f + ALDH - ) and undifferentiated (EpCAM + CD49f + ALDH + ) luminal progenitors. In addition, approximately one-quarter of human breast samples examined contained an additional population that had a distinct luminal progenitor phenotype, characterised by low expression of ERBB3 and low proliferative potential. Parent-progeny relationship experiments demonstrated that all luminal progenitor populations in both species are highly plastic and, at low frequencies, can generate progeny representing all mammary cell types. The ER - luminal progenitors in the mouse and the ALDH + luminal progenitors in the human appear to be analogous populations since they both have gene signatures that are associated with alveolar differentiation and resemble those obtained from basal-like breast tumours. Conclusion The luminal cell compartment in the mammary epithelium is more heterogeneous than initially perceived since progenitors of varying levels of luminal cell differentiation and proliferative capacities can be identified. An understanding of these cells will be essential for understanding the origins and the cellular context of human breast tumours.

Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is a powerful tool for studying complex biological systems, such as tumor heterogeneity and tissue microenvironments. However, the sources of technical and biological variation in primary solid tumor tissues and patient-derived mouse xenografts for scRNA-seq are not well understood.

Accurate measurement of clonal genotypes, mutational processes, and replication states from individual tumor-cell genomes will facilitate improved understanding of tumor evolution. We have developed DLP+, a scalable single-cell whole-genome sequencing platform implemented using commodity instruments, image-based object recognition, and open source computational methods. Using DLP+, we have generated a resource of 51,926 single-cell genomes and matched cell images from diverse cell types including cell lines, xenografts, and diagnostic samples with limited material. From this resource we have defined variation in mitotic mis-segregation rates across tissue types and genotypes. Analysis of matched genomic and image measurements revealed correlations between cellular morphology and genome ploidy states. Aggregation of cells sharing copy number profiles allowed for calculation of single-nucleotide resolution clonal genotypes and inference of clonal phylogenies and avoided the limitations of bulk deconvolution. Finally, joint analysis over the above features defined clone-specific chromosomal aneuploidy in polyclonal populations.

Tumour fitness landscapes underpin selection in cancer, impacting etiology, evolution and response to treatment. Progress in defining fitness landscapes has been impeded by a lack of timeseries perturbation experiments over realistic intervals at single cell resolution. We studied the nature of clonal dynamics induced by genetic and pharmacologic perturbation with a quantitative fitness model developed to ascribe quantitative selective coefficients to individual cancer clones, enable prediction of clone-specific growth potential, and forecast competitive clonal dynamics over time. We applied the model to serial single cell genome ( > 60,000 cells) and transcriptome ( > 58,000 cells) experiments ranging from 10 months to 2.5 years in duration. We found that genetic perturbation of TP53 in epithelial cell lines induces multiple forms of copy number alteration that confer increased fitness to clonal populations with measurable consequences on gene expression. In patient derived xenografts, predicted selective coefficients accurately forecasted clonal competition dynamics, that were validated with timeseries sampling of experimentally engineered mixtures of low and high fitness clones. In cisplatin-treated patient derived xenografts, the fitness landscape was inverted in a time-dependent manner, whereby a drug resistant clone emerged from a phylogenetic lineage of low fitness clones, and high fitness clones were eradicated. Moreover, clonal selection mediated reversible drug response early in the selection process, whereas late dynamics in genomically fixed clones were associated with transcriptional plasticity on a fixed clonal genotype. Together, our findings outline causal mechanisms with implication for interpreting how mutations and multi-faceted drug resistance mechanisms shape the etiology and cellular fitness of human cancers.

ABSTRACT Structural genome alterations are determinants of cancer ontogeny and therapeutic response. While bulk genome sequencing has enabled delineation of structural variation (SV) mutational processes which generate patterns of DNA damage, we have little understanding of how these processes lead to cell-to-cell variations which underlie selection and rates of accrual of different genomic lesions. We analysed 309 high grade serous ovarian and triple negative breast cancer genomes to determine their mutational processes, selecting 22 from which we sequenced >22,000 single cell whole genomes across a spectrum of mutational processes. We show that distinct patterns of cell-to-cell variation in aneuploidy, copy number alteration (CNA) and segment length occur in homologous recombination deficiency (HRD) and fold-back inversion (FBI) phenotypes. Widespread aneuploidy through induction of HRD through BRCA1 and BRCA2 inactivation was mirrored by continuous whole genome duplication in HRD tumours, contrasted with early ploidy fixation in FBI. FBI tumours exhibited copy number distributions skewed towards gains, widespread clone-specific variation in amplitude of high-level amplifications, often impacting oncogenes, and break-point variability consistent with progressive genomic diversification, which we termed serriform structural variation (SSV). SSVs were consistent with a CNA-based molecular clock reflecting a continual and distributed process across clones within tumours. These observations reveal previously obscured genome plasticity and evolutionary properties with implications for cancer evolution, therapeutic targeting and response.