Tumor immune cell compositions play a major role in response to immunotherapy, but the heterogeneity and dynamics of immune infiltrates in human cancer lesions remain poorly characterized. Here, we identify conserved intratumoral CD4 and CD8 T cell behaviors in scRNA-seq data from 25 melanoma patients. We discover a large population of CD8 T cells showing continuous progression from an early effector "transitional" into a dysfunctional T cell state. CD8 T cells that express a complete cytotoxic gene set are rare, and TCR sharing data suggest their independence from the transitional and dysfunctional cell states. Notably, we demonstrate that dysfunctional T cells are the major intratumoral proliferating immune cell compartment and that the intensity of the dysfunctional signature is associated with tumor reactivity. Our data demonstrate that CD8 T cells previously defined as exhausted are in fact a highly proliferating, clonal, and dynamically differentiating cell population within the human tumor microenvironment.

The emergence and diversification of cell types is a leading factor in animal evolution. So far, systematic characterization of the gene regulatory programs associated with cell type specificity was limited to few cell types and few species. Here, we perform whole-organism single-cell transcriptomics to map adult and larval cell types in the cnidarian Nematostella vectensis, a non-bilaterian animal with complex tissue-level body-plan organization. We uncover eight broad cell classes in Nematostella, including neurons, cnidocytes, and digestive cells. Each class comprises different subtypes defined by the expression of multiple specific markers. In particular, we characterize a surprisingly diverse repertoire of neurons, which comparative analysis suggests are the result of lineage-specific diversification. By integrating transcription factor expression, chromatin profiling, and sequence motif analysis, we identify the regulatory codes that underlie Nematostella cell-specific expression. Our study reveals cnidarian cell type complexity and provides insights into the evolution of animal cell-specific genomic regulation.

ABSTRACT Scaling scRNA-seq to profile millions of cells is increasingly feasible. Such data is crucial for the construction of high-resolution maps of transcriptional manifolds. But current analysis strategies, in particular dimensionality reduction and two-phase clustering, offers only limited scaling and sensitivity to define such manifolds. Here we introduce Metacell-2, a recursive divide and conquer algorithm allowing efficient decomposition of scRNA-seq datasets of any size into small and cohesive groups of cells denoted as metacells. We show the algorithm outperforms current solutions in time, memory and quality. Importantly, Metacell-2 also improves outlier cell detection and rare cell type identification, as we exemplify by analysis of human bone marrow cell atlas and mouse embryonic data. Metacell-2 is implemented over the scanpy framework for easy integration in any analysis pipeline.

ABSTRACT The hourglass model describes the convergence of species within the same phylum to a similar body plan during development, yet the molecular mechanisms underlying this phenomenon in mammals remain poorly described. Here, we compare rabbit and mouse time-resolved differentiation trajectories to revisit this model at single cell resolution. We modeled gastrulation dynamics using hundreds of embryos sampled between gestation days 6.0-8.5, and compare the species using a new framework for time-resolved single-cell differentiation-flows analysis. We find convergence toward similar cell state compositions at E7.5, underlied by quantitatively conserved expression of 76 transcription factors, despite divergence in surrounding trophoblast and hypoblast signaling. However, we observed noticeable changes in specification timing of some lineages, and divergence of primordial germ cells programs, which in the rabbit do not activate mesoderm genes. Comparative analysis of temporal differentiation models provides a new basis for studying the evolution of gastrulation dynamics across mammals.

ABSTRACT We describe MCProj - an algorithm for analyzing query scRNA-seq data by projections over reference single cell atlases. We represent the reference as a manifold consisting of annotated metacell gene expression distributions. We then infer query metacells as mixtures of atlas distributions while correcting for technology-specific gene biases. This approach distinguishes and tags query cells that are consistent with existing atlas states from novel or artifactual behaviors that are not observed in the atlas. It also identifies significant expression differences observed in query states that are mapped coherently onto the atlas. We showcase MCProj functionality by analyzing blood gene expression from multiple sources and technologies, suggesting it as a method of choice for scRNA-seq analysis following extensive cell atlas projects.

Abstract Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) deliver life-long multi-lineage output. However, with aging, we exhibit certain characteristic blood count changes and accumulation of clonal disorders. Better understanding of inter-individual variation in HSPC behavior is needed to understand these age-related phenomena and the transition from health to chronic and acute hematological malignancies. Here we study 627K single circulating CD34+ HSPCs (cHSPCs) from 148 healthy individuals, along with their clinical information and clonal hematopoiesis (CH) profiles, to characterize population-wide and age-related hematopoietic variability. Individuals with CH were linked with reduced frequencies of lymphocyte progenitors and higher RDW. An age-related decrease in lymphoid progenitors was observed, predominantly in males. Inter-individual transcriptional variation in expression of a Lamin-A signature and stemness gene programs were linked with aging and presence of macrocytic anemia. Based on our model for healthy cHSPC variation we construct the normal reference for cHSPC subtype frequencies. We show how compositional and expression deviations from this normal reference can robustly identify myeloid malignancies and pre-malignant states. Together, our data and methodologies present a novel resource, shedding light on various age-related hematopoietic processes, and a comprehensive normal cHSPC reference, which can serve as a tool for diagnosing and characterizing hematological disorders.

The developing placenta, which in mice originates through the extraembryonic ectoderm (ExE), is essential for mammalian embryonic development. Yet unbiased characterization of the differentiation dynamics of the ExE and its interactions with the embryo proper remains incomplete. Here we develop a temporal single-cell model of mouse gastrulation that maps continuous and parallel differentiation in embryonic and extraembryonic lineages. This is matched with a three-way perturbation approach to target signalling from the embryo proper, the ExE alone, or both. We show that ExE specification involves early spatial and transcriptional bifurcation of uncommitted ectoplacental cone cells and chorion progenitors. Early BMP4 signalling from chorion progenitors is required for proper differentiation of uncommitted ectoplacental cone cells and later for their specification towards trophoblast giant cells. We also find biphasic regulation by BMP4 in the embryo. The early ExE-originating BMP4 signal is necessary for proper mesoendoderm bifurcation and for allantois and primordial germ cell specification. However, commencing at embryonic day 7.5, embryo-derived BMP4 restricts the primordial germ cell pool size by favouring differentiation of their extraembryonic mesoderm precursors towards an allantois fate. ExE and embryonic tissues are therefore entangled in time, space and signalling axes, highlighting the importance of their integrated understanding and modelling in vivo and in vitro.

Genome wide chromosome conformation capture (Hi-C) is used to interrogate contact frequencies among genomic elements at multiple scales and intensities, ranging from high frequency interactions among proximal regulatory elements, through specific long-range loops between insulator binding sites and up to rare and transient cis- and trans-chromosomal contacts. Visualization and statistical analysis of Hi-C data is made difficult by the extreme variation in the background frequencies of chromosomal contacts between elements at short and long genomic distances. Here we introduce SHAMAN for performing Hi-C analysis at dynamic scales, without predefined resolution, and while minimizing biases over very large datasets. Algorithmically, we devise a Markov Chain Monte Carlo-like procedure for randomizing contact matrices such that coverage and contact distance distributions are preserved. We combine this strategy with bin-free assessment of contact enrichment using a K-nearest neighbor approach. We show how to use the new method for visualizing contact hotspots and for quantifying differential contacts in matching Hi-C maps. We demonstrate how contact preferences among regulatory elements, including promoters, enhancers and insulators can be assessed with minimal bias by comparing pooled empirical and randomized matrices. Full support for our methods is available in a new software package that is freely available.

Spontaneous or pharmacological loss of epigenetic repression exposes thousands of promoters encoded in transposable elements (TEs) for pervasive transcriptional activation. How TE responses differ between epigenetically relaxed cancer cells and what factors govern such variation remains however largely unknown. By quantifying TE transcription initiation at single cell and locus resolution in epigenetically targeted cancer cells, we characterize specific groups of co-regulated loci that drive over ten-fold variation in TE load per single cell. Such variable activity patterns are largely linked to cell cycle stages, stress response signatures, and immune pathways. Furthermore, cells with high levels of specific transcription factors show increased TE expression, while within such cells, multi-copy families are differentially regulated in response to local sequence divergence of binding sites and the locus’ repressive or active chromosomal contexts. Our data thereby implicates the regulation of potent promoters within TEs as an underestimated source of transcriptional heterogeneity following epigenetic therapy.

A hallmark of animal evolution is the emergence and diversification of cell type-specific transcriptional states. But systematic and unbiased characterization of differentiated gene regulatory programs was so far limited to specific tissues in a few model species. Here, we perform whole-organism single cell transcriptomics to map cell types in the cnidarian Nematostella vectensis, a non-bilaterian animal that display complex tissue-level bodyplan organization. We uncover high diversity of transcriptional states in Nematostella, demonstrating cell type-specific expression for 35% of the genes and 51% of the transcription factors (TFs) detected. We identify eight broad cell clusters corresponding to cell classes such as neurons, muscles, cnidocytes, or digestive cells. These clusters comprise multiple cell modules expressing diverse and specific markers, uncovering in particular a rich repertoire of cells associated with neuronal markers. TF expression and sequence analysis defines the combinatorial code that underlies this cell-specific expression. It also reveals the existence of a complex regulatory lexicon of TF binding motifs encoded at both enhancer and promoters of Nematostella tissue-specific genes. Whole organism single cell RNA-seq is thereby established as a tool for comprehensive study of genome regulation and cell type evolution.