Eukaryotic genomes are packaged into a 3-dimensional structure in the nucleus. Current methods for studying genome-wide structure are based on proximity ligation. However, this approach can fail to detect known structures, such as interactions with nuclear bodies, because these DNA regions can be too far apart to directly ligate. Accordingly, our overall understanding of genome organization remains incomplete. Here, we develop split-pool recognition of interactions by tag extension (SPRITE), a method that enables genome-wide detection of higher-order interactions within the nucleus. Using SPRITE, we recapitulate known structures identified by proximity ligation and identify additional interactions occurring across larger distances, including two hubs of inter-chromosomal interactions that are arranged around the nucleolus and nuclear speckles. We show that a substantial fraction of the genome exhibits preferential organization relative to these nuclear bodies. Our results generate a global model whereby nuclear bodies act as inter-chromosomal hubs that shape the overall packaging of DNA in the nucleus.

ABSTRACT Eukaryotic genomes are packaged into a 3-dimensional structure in the nucleus of each cell. There are currently two distinct views of genome organization that are derived from different technologies. The first view, derived from genome-wide proximity ligation methods (e.g. Hi-C), suggests that genome organization is largely organized around chromosomes. The second view, derived from in situ imaging, suggests a central role for nuclear bodies. Yet, because microscopy and proximity-ligation methods measure different aspects of genome organization, these two views remain poorly reconciled and our overall understanding of how genomic DNA is organized within the nucleus remains incomplete. Here, we develop Split-Pool Recognition of Interactions by Tag Extension (SPRITE), which moves away from proximity-ligation and enables genome-wide detection of higher-order DNA interactions within the nucleus. Using SPRITE, we recapitulate known genome structures identified by Hi-C and show that the contact frequencies measured by SPRITE strongly correlate with the 3-dimensional distances measured by microscopy. In addition to known structures, SPRITE identifies two major hubs of inter-chromosomal interactions that are spatially arranged around the nucleolus and nuclear speckles, respectively. We find that the majority of genomic regions exhibit preferential spatial association relative to one of these nuclear bodies, with regions that are highly transcribed by RNA Polymerase II organizing around nuclear speckles and transcriptionally inactive and centromere-proximal regions organizing around the nucleolus. Together, our results reconcile the two distinct pictures of nuclear structure and demonstrate that nuclear bodies act as inter-chromosomal hubs that shape the overall 3-dimensional packaging of genomic DNA in the nucleus.

ABSTRACT T cell receptor (TCR) gene therapy is a promising cell therapy approach for the treatment of cancer. However, most naturally occurring TCRs display low affinities to their peptide-MHC targets, and engineering of TCRs for enhanced affinity is complicated by the risk of introducing cross-reactivity and the poor correlation between affinity and function. Here we report the establishment of the TCR-accepting T cell (TnT) platform through five sequential CRISPR-Cas9 genome editing steps of a human T cell line, and demonstrate its application for functional engineering of TCRs and prediction of cross-reactivity. Using the TnT platform, we profile the mutational landscapes of tumor-specific TCRs at high-throughput to reveal a substantial discordance between antigen binding and antigen-induced signaling. Furthermore, we combine CRISPR-targeting, functional selection and deep sequencing to screen TCR mutagenesis libraries and identify variants with enhanced recognition of the cancer-testis antigen MAGE-A3. Finally, functional cross-reactivity profiling using TnT cells was able to accurately predict off-targets and identify engineered TCRs with exquisite specificity to MAGE-A3. Thus, the TnT platform represents a valuable technology for the engineering of TCRs with enhanced functional and safety profiles.

Summary Existing approaches for the integration and expression of genes of interest in a desired human cellular context are marred by the safety concerns related to either the random nature of viral-mediated integration or unpredictable pattern of gene expression in currently employed targeted genomic integration sites. Disadvantages of these methods lead to their limited use in clinical practice, thus encouraging future research in identifying novel human genomic sites that allow for predictable and safe expression of genes of interest. We conducted a bioinformatic search followed by experimental validation of novel genomic sites and identified two that demonstrated stable expression of integrated reporter and therapeutic genes without detrimental changes to cellular transcriptome. The cell-type agnostic criteria used in our bioinformatic search suggest wide-scale applicability of our sites for engineering of a diverse range of tissues for therapeutic as well as enhancement purposes, including modified T-cells for cancer therapy and engineered skin to ameliorate inherited diseases and aging. Additionally, the stable and robust levels of gene expression from identified sites allow for their use in industry-scale biomanufacturing of desired proteins in human cells.