Paul Boutros, Robert Bristow and colleagues report a molecular analysis of the spatial heterogeneity of clinically localized, multifocal prostate cancer. They find that multifocal tumors are highly heterogeneous, and they identify a novel recurrent amplification of MYCL1. Herein we provide a detailed molecular analysis of the spatial heterogeneity of clinically localized, multifocal prostate cancer to delineate new oncogenes or tumor suppressors. We initially determined the copy number aberration (CNA) profiles of 74 patients with index tumors of Gleason score 7. Of these, 5 patients were subjected to whole-genome sequencing using DNA quantities achievable in diagnostic biopsies, with detailed spatial sampling of 23 distinct tumor regions to assess intraprostatic heterogeneity in focal genomics. Multifocal tumors are highly heterogeneous for single-nucleotide variants (SNVs), CNAs and genomic rearrangements. We identified and validated a new recurrent amplification of MYCL, which is associated with TP53 deletion and unique profiles of DNA damage and transcriptional dysregulation. Moreover, we demonstrate divergent tumor evolution in multifocal cancer and, in some cases, tumors of independent clonal origin. These data represent the first systematic relation of intraprostatic genomic heterogeneity to predicted clinical outcome and inform the development of novel biomarkers that reflect individual prognosis.

Abstract Third generation sequencing technologies from platforms such as Oxford Nanopore Technologies and Pacific Biosciences have paved the way for building more contiguous assemblies and complete reconstruction of genomes. The larger effective length of the reads generated with these technologies has provided a mean to overcome the challenges of short to mid-range repeats. Currently, accurate long read assemblers are computationally expensive while faster methods are not as accurate. Therefore, there is still an unmet need for tools that are both fast and accurate for reconstructing small and large genomes. Despite the recent advances in third generation sequencing, researchers tend to generate second generation reads for many of the analysis tasks. Here, we present HASLR, a hybrid assembler which uses both second and third generation sequencing reads to efficiently generate accurate genome assemblies. Our experiments show that HASLR is not only the fastest assembler but also the one with the lowest number of misassemblies on all the samples compared to other tested assemblers. Furthermore, the generated assemblies in terms of contiguity and accuracy are on par with the other tools on most of the samples. Availability HASLR is an open source tool available at https://github.com/vpc-ccg/haslr .

Abstract Androgen receptor (AR) is critical to the initiation, growth and progression of almost all prostate cancers. Once activated, the AR binds to cis -regulatory enhancer elements on DNA that drive gene expression. Yet, there are 10-100x more binding sites than differentially expressed genes. It still remains unclear how individual sites contribute to AR-mediated transcription. While descriptive functional genomic approaches broadly correlate with enhancer activity, they do not provide the locus-specific resolution needed to delineate the underlying regulatory logic of AR-mediated transcription. Therefore, we functionally tested all commonly occuring clinical AR binding sites with Self-Transcribing Active Regulatory Regions sequencing (STARRseq) to generate the first map of intrinsic AR enhancer activity. This approach is not significantly affected by endogenous chromatin modifications and measures the potential enhancer activity at each cis -regulatory element. Interestingly we found that only 7% of AR binding sites displayed increased enhancer activity upon hormonal stimulation. Instead, the vast majority of AR binding sites were either inactive (81%) or constitutively active enhancers (11%). These annotations strongly correlated with enhancer-associated features in both cell line and clinical prostate cancer. With these validated annotations we next investigated the effect of each enhancer class on transcription and found that AR-driven inducible enhancers frequently interacted with promoters, forming central chromosomal loops critical for gene transcription. We demonstrated that these inducible enhancers act as regulatory hubs that increase contacts with both other AR binding sites and gene promoters. This functional map was used to identify a somatic mutation that significantly reduces the expression of a commonly mutated AR-regulated tumour suppressor. Together, our data reveal a complex interplay between different AR binding sites that work in a highly coordinated manner to drive gene transcription.

Summary Single-cell RNA sequencing allows for characterizing the gene expression landscape at the cell type level. However, because of its use of short-reads, it is severely limited at detecting full-length features of transcripts such as alternative splicing. New library preparation techniques attempt to extend single-cell sequencing by utilizing both long-and short-reads. These techniques split the library material, after it is tagged with cellular barcodes, into two pools: one for short-read sequencing and one for long-read sequencing. However, the challenge of utilizing these techniques is that they require matching the cellular barcodes sequenced by the erroneous long-reads to the cellular barcodes detected by the short-reads. To overcome this challenge, we introduce scTagger, a computational method to match cellular barcodes data from long-and short-reads. We tested scTagger against another state-of-the-art tool on both real and simulated datasets and we demonstrate that scTagger has both significantly better accuracy and time efficiency.

Abstract Alternative splicing (AS) is an important mechanism in the development of many cancers, as novel or aberrant AS patterns play an important role as an independent onco-driver. In addition, cancer-specific AS is potentially an effective target of personalized cancer therapeutics. However, detecting AS events remains a challenging task, especially if these AS events are not pre-annotated. This is exacerbated by the fact that existing transcriptome annotation databases are far from being comprehensive, especially with regard to cancer-specific AS. Additionally, traditional sequencing technologies are severely limited by the short length of the generated reads, that rarely spans more than a single splice junction site. Given these challenges, transcriptomic long-read (LR) sequencing presents a promising potential for the detection and discovery of AS. We present Freddie, a computational annotation-independent isoform discovery and detection tool. Freddie takes as input transcriptomic LR sequencing of a sample and computes a set of isoforms for the given sample. Freddie takes as input the genomic alignment of the transcriptomic LRs generated by a splice aligner. It then partitions the reads to sets that can be processed independently and in parallel. For each partition, Freddie segments the genomic alignment of the reads into canonical exon segments. The goal of this segmentation is to be able to represent any potential isoform as a subset of these canonical exons. This segmentation is formulated as an optimization problem and is solved with a Dynamic Programming algorithm. Then, Freddie reconstructs the isoforms by jointly clustering and error-correcting the reads using the canonical segmentation as a succinct representation. The clustering and error-correcting step is formulated as an optimization problem – the Minimum Error Clustering into Isoforms (MErCi) problem – and is solved using Integer Linear Programming (ILP). We compare the performance of Freddie on simulated datasets with other isoform detection tools with varying dependence on annotation databases. We show that Freddie outperforms the other tools in its recall, including those given the complete ground truth annotation. In terms of false positive rate, Freddie performs comparably to the other tools. We also run Freddie on a transcriptomic LR dataset generated in-house from a prostate cancer cell line. Freddie detects a potentially novel Androgen Receptor isoform that includes novel intron retention. We cross-validate this novel intron retention using orthogonal publicly available short-read RNA-seq datasets. Availability Freddie is open source and available at https://bitbucket.org/baraaorabi/freddie

ABSTRACT Androgen receptor (AR)-mediated transcription plays a critical role in normal prostate development and prostate cancer growth. AR drives gene expression by binding to thousands of cis-regulatory elements (CRE) that loop to hundreds of target promoters. With multiple CREs interacting with a single promoter, it remains unclear how individual AR bound CREs contribute to gene expression. To characterize the involvement of these CREs, we investigated the AR-driven epigenetic and chromosomal chromatin looping changes. We collected a kinetic multiomic dataset comprised of steady-state mRNA, chromatin accessibility, transcription factor binding, histone modifications, chromatin looping, and nascent RNA. Using an integrated regulatory network, we found that AR binding induces sequential changes in the epigenetic features at CREs, independent of gene expression. Further, we showed that binding of AR does not result in a substantial rewiring of chromatin loops, but instead increases the contact frequency of pre-existing loops to target promoters. Our results show that gene expression strongly correlates to the changes in contact frequency. We then proposed and experimentally validated an unbalanced multi-enhancer model where the impact on gene expression of AR-bound enhancers is heterogeneous, and is proportional to their contact frequency with target gene promoters. Overall, these findings provide new insight into AR-mediated gene expression upon acute androgen simulation and develop a mechanistic framework to investigate nuclear receptor mediated perturbations.

Abstract Motivation Increasing amounts of individual genomes sequenced per species motivate the usage of pangenomic approaches. Pangenomes may be represented as graphical structures, e.g. compacted colored de Bruijn graphs, which offer a low memory usage and facilitate reference-free sequence comparisons. While sequence-to-graph mapping to graphical pangenomes has been studied for some time, no local alignment search tool in the vein of BLAST has been proposed yet. Results We present a new heuristic method to find maximum scoring local alignments of a DNA query sequence to a pangenome represented as a compacted colored de Bruijn graph. Our approach additionally allows a comparison of similarity among sequences within the pangenome. We show that local alignment scores follow an exponential-tail distribution similar to BLAST scores, and we discuss how to estimate its parameters to separate local alignments representing sequence homology from spurious findings. An implementation of our method is presented, and its performance and usability are shown. Our approach scales sublinearly in running time and memory usage with respect to the number of genomes under consideration. This is an advantage over classical methods that do not make use of sequence similarity within the pangenome.

Recent technological advances in single cell sequencing (SCS) provide high resolution data for studying intra-tumor heterogeneity and tumor evolution. Available computational methods for tumor phylogeny inference via SCS typically aim to identify the most likely perfect phylogeny tree satisfying infinite sites assumption (ISA). However limitations of SCS technologies such as frequent allele dropout or highly variable sequence coverage, commonly result in mutational call errors and prohibit a perfect phylogeny. In addition, ISA violations are commonly observed in tumor phylogenies due to the loss of heterozygosity, deletions and convergent evolution. In order to address such limitations, we, for the first time, introduce a new combinatorial formulation that integrates single cell sequencing data with matching bulk sequencing data, with the objective of minimizing a linear combination of (i) potential false negatives (due to e.g. allele dropout or variance in sequence coverage) and (ii) potential false positives (due to e.g. read errors) among mutation calls, as well as (iii) the number of mutations that violate ISA - to define the optimal sub-perfect phylogeny. Our formulation ensures that several lineage constraints imposed by the use of variant allele frequencies (VAFs, derived from bulk sequence data) are satisfied. We express our formulation both in the form of an integer linear program (ILP) and - for the first time in the context of tumor phylogeny reconstruction - a boolean constraint satisfaction problem (CSP) and solve them by leveraging state-of-the-art ILP/CSP solvers. The resulting method, which we name PhISCS, is the first to integrate SCS and bulk sequencing data under the finite sites model. Using several simulated and real SCS data sets, we demonstrate that PhISCS is not only more general but also more accurate than the alternative tumor phylogeny inference tools. PhISCS is very fast especially when its CSP based variant is used returns the optimal solution, except in rare instances for which it provides an optimality gap. PhISCS is available at https://github.com/haghshenas/PhISCS.

Malignant Peritoneal Mesothelioma (PeM) is a rare and fatal cancer that originates from the peritoneal lining of the abdomen. Standard treatment of PeM is limited to cytoreductive surgery and/or chemotherapy, and no effective targeted therapies for PeM exist. Some immune checkpoint inhibitor studies of mesothelioma have found positivity to be associated with a worse prognosis. To search for novel therapeutic targets for PeM, we performed a comprehensive integrative multi-omics analysis of the genome, transcriptome, and proteome of 19 treatment-naive PeM, and in particular we examined BAP1 mutation and copy-number status and its relationship to immune checkpoint inhibitor activation. We found that PeM could be divided into tumors with an inflammatory tumor microenvironment and those without, and that this distinction correlated with haploinsufficiency of BAP1. To further investigate the role of BAP1, we used our recently developed cancer driver gene prioritization algorithm, HITnDRIVE, and observed that PeM with BAP1 haploinsufficiency form a distinct molecular subtype characterized by distinct gene expression patterns of chromatin remodeling, DNA repair pathways, and immune checkpoint receptor activation. We demonstrate that this subtype is correlated with an inflammatory tumor microenvironment and thus is a candidate for immune checkpoint blockade therapies. Our findings reveal BAP1 to be a potential, easily trackable prognostic and predictive biomarker for PeM immunotherapy that refines PeM disease classification. BAP1 stratification may improve drug response rates in ongoing phase-I and II clinical trials exploring the use of immune checkpoint blockade therapies in PeM in which BAP1 status is not considered. This integrated molecular characterization provides a comprehensive foundation for improved management of a subset of PeM patients.

Rapid advancement in high throughput genome and transcriptome sequencing (HTS) and mass spectrometry (MS) technologies has enabled the acquisition of the genomic, transcriptomic and proteomic data from the same tissue sample.In this paper we introduce a novel computational framework which can integratively analyze all three types of omics data to obtain a complete molecular profile of a tissue sample, in normal and disease conditions.Our framework includes MiStrVar, an algorithmic method we developed to identify micro structural variants (microSVs) on genomic HTS data. Coupled with deFuse, a popular gene fusion detection method we developed earlier, MiStrVar can provide an accurate profile of structurally aberrant transcripts in cancer samples.Given the breakpoints obtained by MiStrVar and deFuse, our framework can then identify all relevant peptides that span the breakpoint junctions and match them with unique proteomic signatures in the respective proteomics data sets. Our framework's ability to observe structural aberrations at three levels of omics data provides means of validating their presence. We have applied our framework to all The Cancer Genome Atlas (TCGA) breast cancer Whole Genome Sequencing (WGS) and/or RNA-Seq data sets, spanning all four major subtypes, for which proteomics data from Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) have been released.A recent study on this dataset focusing on SNVs has reported many that lead to novel peptides.Complementing and significantly broadening this study, we detected 244 novel peptides from 432 candidate genomic or transcriptomic sequence aberrations. Many of the fusions and microSVs we discovered have not been reported in the literature.Interestingly, the vast majority of these translated aberrations (in particular, fusions) were private, demonstrating the extensive inter-genomic heterogeneity present in breast cancer.Many of these aberrations also have matching out-of-frame downstream peptides, potentially indicating novel protein sequence and structure. Moreover, the most significantly enriched genes involved in translated fusions are cancer-related.Furthermore a number of the somatic, translated microSVs are observed in tumor suppressor genes.