Abstract Full-length transcript sequencing remains a main goal of RNA sequencing. However, even the application of long-read sequencing technologies such as Oxford Nanopore Technologies still fail to yield full-length transcript sequencing for a significant portion of sequenced reads. Since these technologies can sequence reads that are far longer than the longest known processed transcripts, the lack of efficiency to obtain full-length transcripts from good quality RNAs stems from library preparation inefficiency rather than the presence of degraded RNA molecules. It has previously been shown that addition of inverted terminal repeats in cDNA during reverse transcription followed by single-primer PCR creates a PCR suppression effect that prevents amplification of short molecules thus enriching the library for longer transcripts. We adapted this method for Nanopore cDNA library preparation and show that not only is PCR efficiency increased but gene body coverage is dramatically improved. The results show that implementation of this simple strategy will result in better quality full-length RNA sequencing data and make full-length transcript sequencing possible for most of sequenced reads. Contribution to the field Long-read RNA sequencing aims to sequence expressed transcripts in their entirety. However, this has remained a challenge, mainly due to inherent inefficiencies in cDNA library preparation. Herein, we provide a new Nanopore cDNA library preparation protocol, termed Panhandle, that improves the efficiency of cDNA PCR with yields 2 – 8 times the yields obtained with ordinary PCR. This is key, as this should in turn reflect in the possibility of lowering the number of PCR cycles needed to obtain ample sequencing material, which in turn could reduce PCR biases, PCR artifacts, turnaround time, reagents, and could increase general quality of the library. Further, transcripts generated using the Panhandle method show better gene body coverage and more accurate transcription start site mapping than regular methods. This represents an important step towards full-length cDNA sequencing by Nanopore.

Long-read sequencing has greatly contributed to the generation of high quality assemblies, albeit at a high cost. It is also not always clear how to combine sequencing platforms. We sequenced the genome of the olive fruit fly (Bactrocera oleae), the most important pest in the olive fruits agribusiness industry, using Illumina short-reads, mate-pairs, 10x Genomics linked-reads, Pacific Biosciences (PacBio), and Oxford Nanopore Technologies (ONT). The 10x linked-reads assembly gave the most contiguous assembly with an N50 of 2.16 Mb. Scaffolding the linked-reads assembly using long-reads from ONT gave a more contiguous assembly with scaffold N50 of 4.59 Mb. We also present the most extensive transcriptome datasets of the olive fly derived from different tissues and stages of development. Finally, we used the Chromosome Quotient method to identify Y-chromosome scaffolds and show that the long-reads based assembly generates very highly contiguous Y-chromosome assembly.

The olive fruit fly or olive fly (Bactrocera oleae) is the most important pest of cultivated olive trees. Like all insects the olive fly undergoes complete metamorphosis. However, the transcription dynamics that occur during early embryonic development have not been explored, while detailed transcriptomic analysis in the absence of a fully annotated genome is challenging. We collected olive fly embryos at hourly intervals for the first 6 hours of development and performed full-length cDNA-Seq using a purpose designed SMARTer cDNA synthesis protocol followed by sequencing on the MinION (Oxford Nanopore Technologies). We generated 31 million total reads across the timepoints (median yield 4.2 million per timepoint). The reads showed 98 % alignment rate to the olive fly genome and 91 % alignment rate to the NBCI predicted B. oleae gene models. Over 50 % of the expressed genes had at least one read covering its entire length validating our full-length RNA-Seq procedure. Expression of 68 % of the predicted B. oleae genes was detected in the first six hours of development. We generated a de novo transcriptome assembly of the olive fly and identified 3553 novel genes and a total of 79,810 transcripts; a fourfold increase in transcriptome diversity compared to the NCBI predicted transcriptome. On a global scale, the first six hours of embryo development were characterized by dramatic transcriptome changes with the total number of transcripts per embryo dropping to half from the first hour to the second hour of embryo development. Clustering of genes based on temporal co-expression followed by gene-set enrichment analysiss of genes expressed in the first six hours of embryo development showed that genes involved in transcription and translation, macro-molecule biosynthesis, and neurodevelopment were highly enriched. These data provide the first insight into the transcriptome landscape of the developing olive fly embryo. The data also reveal transcript signatures of sex development. Overall, full-length sequencing of the cDNA molecules permitted a detailed characterization of the isoform complexity and the transcriptional dynamics of the first embryonic stages of the B. oleae.