Abstract Resistance to therapy is an enduring challenge in cancer care. Here we interrogate this critical unmet need using high grade serous ovarian cancer (HGSC) as a disease model. We have generated a unique panel of platinum-resistant HGSC models and shown that they share multiple transcriptomic features with relapsed human HGSC. Moreover, they evolve diverse in vivo phenotypes reflecting the human disease. We previously characterised copy number signatures in HGSC that correlate with patient survival and now provide the first evidence that these signatures undergo recurrent alterations during platinum therapy. Furthermore, specific, resistance-associated signature change is associated with functionally relevant gene expression differences. For example, reduced signature 3 (BRCA1/2-related homologous recombination deficiency) is associated with increased expression of homologous recombination repair genes (Rad51C, Rad51D, BRCA1) and DNA recombination pathway enrichment. Our mechanistic examination therefore provides new and clinically relevant insights into the genomic evolution of platinum-resistant cancers.

In vitro preclinical testing of chimeric antigen receptor (CAR) T cells is mostly carried out in monolayer cell cultures. However, alternative strategies are needed to take into account the complexity and the effects of the tumor microenvironment. Here, we describe the modulation of CAR T-cell activity by malignant cells and fibroblasts in human three-dimensional (3D) in vitro cell models of increasing complexity. In models combining mucin-1 (MUC1) and TnMUC1 CAR T cells with human high-grade serous ovarian cancer cell spheroids, malignant cell-intrinsic resistance to CAR T-cell killing was due to defective death receptor signaling involving TNFα. Adding primary human fibroblasts to spheroids unexpectedly increased the ability of CAR T cells to kill resistant malignant cells as CCL2 produced by fibroblasts activated CCR2/4+ CAR T cells. However, culturing malignant cells and fibroblasts in collagen gels engendered production of a dense extracellular matrix that impeded CAR T-cell activity in a TGFβ-dependent manner. A vascularized microfluidic device was developed that allowed CAR T cells to flow through the vessels and penetrate the gels in a more physiological way, killing malignant cells in a TNFα-dependent manner. Complex 3D human cell models may provide an efficient way of screening multiple cytotoxic human immune cell constructs while also enabling evaluation of mechanisms of resistance involving cell-cell and cell-matrix interactions, thus accelerating preclinical research on cytotoxic immune cell therapies in solid tumors. Significance: Three-dimensional in vitro models of increasing complexity uncover mechanisms of resistance to CAR T cells in solid tumors, which could help accelerate development of improved CAR T-cell constructs.

Abstract Non-coding mutations (NCMs) that perturb the function of cis -regulatory elements (CRE, enhancers) contribute to cancer. Due to the vast search space, mutation abundance and indirect activity of non-coding sequences, it is challenging to identify which somatic NCMs are contributing to tumour development and progression. Here, we focus our investigation on the somatic NCMs that are enriched at enhancers from 659 pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) tumours. We identify cis -regulatory NCMs within PDAC-specific enhancers derived from high and low-grade PDAC cell lines and patient derived organoids using two independent computational approaches. Five such CREs enriched for PDAC associated NCMs are also frequently mutated in other common solid tumours. Functional validation using STARR-seq reporter assays enables the prioritisation of 43 NCMs (7.3%) from a pool of 587 NCMs with 6,082 oligos, that significantly alter reporter enhancer activity compared to wild-type sequences. CRISPRi perturbation of an enhancer cluster harbouring NCMs over long non-coding RNA gene MIR100HG , which hosts a microRNA cluster (mir100-let7a-2-125b-1), leads to the downregulation of MIR100HG accompanied by a significant reduction in the TGF-β pathway (known to induce MIR100HG ) and other PDAC critical pathways, including KRAS, p53, MTOR and TNF α signalling. Collectively, we have reported here cis -regulatory NCMs in PDAC proximal to many cancer-relevant genes, and our integrated approach paves way to explore CRE-associated NCMs in other human cancer genomes.

Abstract Recent studies have shown the tumor extracellular matrix (ECM) associates with immunosuppression, and that targeting the ECM can improve immune infiltration and immunotherapy response. A question that remains is whether the ECM is directly educating the immune phenotypes seen in cancer. We identified a tumor-associated macrophage (TAM) population correlated with poor prognosis, interruption of the cancer immunity cycle, and tumor ECM composition. To investigate whether ECM was capable of generating the TAM phenotype seen, we developed a decellularized tissue model that retains the native ECM architecture and composition. Macrophages cultured on decellularized ovarian metastasis shared transcriptional profiles with the TAMs found in human tissues. ECM educated macrophages have a tissue remodeling and immunoregulatory phenotype, inducing altered T cell function. We conclude that the tumor ECM is directly educating this macrophage population found in cancer tissues. Therefore, current and emerging cancer therapies that target the tumor ECM may be tailored to improve macrophage phenotype and their downstream regulation of immunity.

Abstract In a multi-level ‘deconstruction’ of omental metastases, we previously identified a prognostic matrisome gene expression signature in high-grade serous ovarian cancer (HGSOC) and twelve other malignancies. Here, our aim was to understand how six of these extracellular matrix, ECM, molecules, COL11A1, COMP, FN1, VCAN, CTSB and COL1A1, are up-regulated in cancer. Using biopsies, we identified significant associations between TGFβR activity, Hedgehog signalling and these ECM molecules and then studied the associations in mono-, co- and tri-culture. Activated omental fibroblasts produced more matrix than malignant cells, directed by TGFβR and Hedgehog signalling crosstalk. We ‘reconstructed’ omental metastases in tri-culture of HGSOC cells, omental fibroblasts and adipocytes. This combination was sufficient to generate all six ECM proteins and the matrisome expression signature. TGFβR and Hedgehog inhibitor combinations attenuated fibroblast activation, gel remodelling and ECM remodelling in these models. The tri-culture model reproduces key features of omental metastases and allows study of diseased-associated ECM.

Standard of care for multiple myeloma involves autologous hematopoietic cell transplant (AHCT), which can extend life by a year; however the disease remains incurable. A dendritic cell vaccine developed at Moffitt will be used both immediately before and after AHCT, with the aim of achieving complete response. Data will be collected during the trial to test the biological activity of the vaccine. This data will parameterize a model that facilitates the exploration of outcomes when varying the timing of vaccination. This calibrated model will also inform the design of a follow-up trial, which will include vaccination in conjunction with other immunotherapies.

Replication stress can drive genetic instability and is associated with chromosomal instability in cancer and during reprogramming of stem cells, however the exact mechanisms connecting replication stress to chromosome aberrations are not known. Here we use single cell DNA sequencing to precisely map DNA copy number alterations (CNAs) after one cell division cycle under replication stress in two diploid cell types to megabase pair resolution. Unexpectedly, we find that replication stress generates several distinct classes of CNAs, and that specific genomic regions convert to particular classes of CNA. By combining analyses of single cell replication timing and bulk gene expression from both cell types, we provide a comprehensive picture of the features and mechanisms converting replication stress to DNA copy number alterations. The breakpoints of large CNAs tend to be associated with late DNA replication timing, low surrounding gene expression and proximity to large or giant genes. By contrast, small amplifications show contrasting associations and may represent a new class of replication stress induced CNAs. These findings provide a platform to further dissect molecular mechanisms involved in the replication stress response and to gain insights into how replication stress can drive chromosomal instability in cancer.