Abstract Axolotls are uniquely able to resolve spinal cord injuries, but little is known about the mechanisms underlying spinal cord regeneration. We previously found that tail amputation leads to reactivation of a developmental-like program in spinal cord ependymal cells (Rodrigo Albors et al ., 2015), characterized by a high-proliferation zone emerging 4 days post-amputation (Rost et al ., 2016). What underlies this spatiotemporal pattern of cell proliferation, however, remained unknown. Here, we use modelling, tightly linked to experimental data, to demonstrate that this regenerative response is consistent with a signal that recruits ependymal cells during 85 hours after amputation within ~ 830□m of the injury. We adapted FUCCI technology to axolotls (AxFUCCI) to visualize cell cycles in vivo. AxFUCCI axolotls confirmed the predicted appearance time and size of the injury-induced recruitment zone and revealed cell cycle synchrony between ependymal cells. Our modeling and imaging move us closer to understanding bona fide spinal cord regeneration.

Summary The spinal cord neural stem cell potential resides within the ependymal cells lining the central canal. These cells are, however, heterogeneous, and we know little about the biological diversity this represents. Here we use single-cell RNA-sequencing to profile adult mouse spinal cord ependymal cells. We uncover transcriptomes of known subtypes and a new mature ependymal cell state, that becomes more prominent with age. Comparison of ependymal cell transcriptomes from the brain and spinal cord revealed that ongoing cell maturation distinguishes spinal cord ependymal cells from their postmitotic brain counterparts. Using an ex vivo model of spinal cord injury, we show that ependymal cell maturation is reversible but also highly regulated. We revisit ependymal cell identities in adult human spinal cord and uncover evidence for their maturation and surprising ventralisation with age. This first in-depth characterisation of spinal cord ependymal cells paves the way to manipulation of distinct ependymal subtypes, provides insights into ependymal cell maturation dynamics and informs strategies for coaxing ependymal cell-driven spinal cord repair.

The ability to monitor and manipulate epiblast cells in and around the primitive streak of the mouse embryo is important for investigating how cells maintain potency and how distinct cell fates are established. Here, we report development of a key resource for such studies, a mouse line in which a tamoxifen-inducible Cre recombinase construct replaces an endogenous gene, Nkx1.2, whose expression demarcates the epiblast adjacent to and including the primitive streak. We show that this Nkx1.2CreERT2 line drives transgene expression in the endogenous Nkx1.2 domain. Labelling this caudal epiblast cell population at embryonic day (E) 7.5 confirmed contribution to all three germ layers at later stages. Labelled cells were also retained within the caudal lateral epiblast at E8.5 and E9.5 and E10.5 tailbud. A subset of these cells co-expressed early neural (Sox2) and mesodermal (Bra) markers. These findings support the existence of neuromesodermal progenitors within the Nkx1.2 cell lineage. Consistent with the retention of such bipotent progenitors throughout body axis elongation, labelling Nkx1.2-expressing cells at E10.5 and assessment at E11.5 demonstrated continued contribution to both neural and mesodermal lineages. Furthermore, detailed analysis of Nkx1.2 expression revealed a novel domain in tailbud mesenchyme that is contiguous with neural tissue. The presence of labelled Sox2/Bra co-expressing cells in this mesenchyme cell population suggests that this is the retained neuromesodermal progenitor pool, which gives rise to both new paraxial mesoderm and new neural tissue, generated now via secondary neurulation. Here, we introduce this caudal-most Nkx1.2 domain as the neuromesodermal lip.

The vertebrate body forms by continuous generation of new tissue from progenitors at the posterior end of the embryo. In mice, these axial progenitors initially reside in the epiblast, from where they form the trunk; and later relocate to the chordo-neural hinge of the tail bud to form the tail. Among them, a small group of bipotent neuromesodermal progenitors (NMPs) are thought to generate the spinal cord and paraxial mesoderm to the end of axis elongation. The study of these progenitors, however, has proven challenging in vivo due to their small numbers and dynamic nature, and the lack of a unique molecular marker to identify them. Here, we report the generation of the Nkx1.2CreERT2 transgenic mouse line in which the endogenous Nkx1.2 promoter drives tamoxifen-inducible CreERT2 recombinase. We show that Nkx1.2CreERT2 targets axial progenitors, including NMPs and early neural and mesodermal progenitors. Using a YFP reporter, we demonstrate that Nkx1.2-expressing epiblast cells contribute to all three germ layers, mostly neuroectoderm and mesoderm excluding notochord; and continue contributing neural and paraxial mesoderm tissues from the tail bud. This study identifies the Nkx1.2-expressing cell population as the source of most trunk and tail tissues in the mouse; and provides a key tool to genetically label and manipulate this progenitor population in vivo.

Axolotls are unique in their ability to regenerate the spinal cord. However, the mechanisms that underlie this phenomenon remain poorly understood. Previously, we showed that resting stem cells in the axolotl spinal cord revert to a molecular state resembling embryonic neuroepithelial cells and functionally acquire rapid proliferative divisions during regeneration. Here we refine in space and time this increase in cell proliferation during regeneration, and identify a dynamic high-proliferation zone in the regenerating spinal cord. By tracking sparsely-labeled cells, we quantify cell influx into the regenerate. Taking a mathematical modelling approach, we integrate these quantitative biological datasets across cellular and tissue level to provide a mechanistic and quantitative understanding of regenerative spinal cord outgrowth. We find that the acceleration of the cell cycle is necessary and sufficient to drive the outgrowth of the regenerating spinal cord in axolotls.

The ventricular layer of the spinal cord is remodelled during embryonic development and ultimately forms the adult central canal, which retains neural stem cell potential. This anatomical transformation involves the process of dorsal collapse, however, accompanying changes in tissue organization and cell behaviour as well as the origin of cells contributing to the adult central canal are not well understood. Here we describe sequential localised cell rearrangements which contribute to the gradual attrition of the spinal cord ventricular layer during development. This includes local breakdown of the pseudostratified organisation of the dorsal ventricular layer prefiguring dorsal collapse and evidence for a new phenomenon, ventral dissociation, during which the ventral-most floor plate cells separate from a subset that are retained in the central canal. Using cell proliferation markers and cell-cycle reporter mice, we further show that following dorsal collapse, ventricular layer attrition involves an overall reduction in cell proliferation, characterised by an intriguing increase in the percentage of cells in G1/S. In contrast, programmed cell death does not contribute to ventricular layer remodelling. By analysing transcript and protein expression patterns associated with key signalling pathways, we provide evidence for a gradual decline in ventral sonic hedgehog activity and an accompanying ventral expansion of initial dorsal bone morphogenetic protein signalling, which comes to dominate the forming central canal. This study identifies multiple steps that contribute to spinal cord ventricular layer attrition and adds to increasing evidence for the heterogenous origin of the adult spinal cord central canal, which includes cells from the floor plate and the roof plate as well as ventral progenitor domain.