ABSTRACT Base editing technique and PRIME editing techniques derived from the CRISPR/Cas9 discovery permit to modify selected nucleotides. We initially used the base editing technique to introduce in the APP gene the A673T mutation, which prevents the development of Alzheimer’s disease. Although the desired cytidine to thymidine mutation was inserted in up to 17% of the APP gene in HEK393T, there were also modifications of up to 20% of other nearby cytidines. More specific mutations of the APP gene were obtained with the PRIME editing technique. However, the best percentage of mutations was only 5.8%. The efficiency of the PRIME editing treatment was initially tested on the EMX1 gene. A single treatment produced the desired modification in 36% of the EMX1 gene. Three consecutive treatments increased the percentage of mutations to 50%. The PRIME editing technique was also used to insert specific point mutations in exons 9 and 35 of the DMD gene coding for the dystrophin gene and which is mutated in Duchenne Muscular Dystrophy (DMD). Up to 10% desired mutations of the DMD gene were obtained. Three repeated treatments increased the percentage of specific mutations to 16%. Given that there are thousands of nuclei inside a human muscle fiber and that the dystrophin nuclear domain is about 500 μm, this level of modifications would be sufficient to produce a phenotype improvement in DMD patients.

Abstract The accumulation of plaque in the brain leads to the onset and development of Alzheimer’s disease. The Amyloid precursor protein (APP) is usually cut by α-secretase, however an abnormal cleavage profile by β-secretase (BACE1) leads to the accumulation of Aβ peptides, which forms these plaques. Numerous APP gene mutations favor plaque accumulation, causing Familial Alzheimer Disease (FAD). However, a variant of the APP gene (A673T) in Icelanders reduces BACE1 cleavage by 40 %. A library of plasmids containing APP genes with 29 FAD mutations with or without the additional A673T mutation was generated and transfected in neuroblastomas to assess the effect of this mutation on Aβ peptide production. In most cases the production of Aβ peptides was decreased by the co-dominant A673T mutation. The reduction of Aβ peptide concentrations for the London mutation (V717I) even reached the same level as A673T carriers. These results suggest that the insertion of A673T in the APP gene of genetically susceptible FAD patients may prevent the onset of, slow down, or stop the progression of the disease.

It is still unclear if immune responses will compromise the large scale utilization of cell therapies derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). To answer this question, we used humanized mouse models generated by the adoptive transfer of peripheral blood mononuclear cells (Hu-AT) or the co-transplantation of hematopoietic stem cells and human thymic tissue (Hu-BLT). Using these mice we evaluated the engraftment in skeletal muscle of myogenic cells either obtained directly from a muscle biopsy or differentiated from hiPSCs or fibroblasts. Our results showed that while allogeneic grafts were rejected and highly infiltrated with human T cells, engraftment of autologous cells was tolerated, indicating reprogramming and differentiation procedures are not immunogenic. We also observed that hiPSC-derived myogenic progenitors are not targeted by autologous T cells and natural killer (NK) cells in vitro . Overall, our findings suggest that hiPSC-derived myogenic progenitors will be tolerated in the presence of a competent human immune system.SIGNIFICANCE The immunogenicity of human iPSC-derived cells will strongly influence their use in regenerative medicine. This important feature has so far been mostly understudied given the necessity to have access to humanized mice reconstituted with an immune system autologous to iPSC-derived cells. Using two distinct mouse models we here provide evidences that human immune cell infiltration in skeletal muscle should not be used as the sole marker to predict immunogenicity. Indeed, we show that human iPSC-derived myogenic progenitors, similar to primary human myoblasts, induced autologous T cell infiltration yet without compromising engraftment. Our study provides essential pre-clinical data supporting the usage of human iPSC-derived myogenic progenitor cells.