Abstract Cerebral organoids provide unparalleled access to human brain development in vitro. However, variability induced by current culture methodologies precludes using organoids as robust disease models. To address this, we developed an automated Organoid Culture and Assay (ORCA) system to support longitudinal unbiased phenotyping of organoids at scale across multiple patient lines. We then characterized organoid variability using novel machine learning methods and found that the contribution of donor, clone, and batch is significant and remarkably consistent over gene expression, morphology, and cell-type composition. Next, we performed multi-factorial protocol optimization, producing a directed forebrain protocol compatible with 96-well culture that exhibits low variability while preserving tissue complexity. Finally, we used ORCA to study tuberous sclerosis, a disease with known genetics but poorly representative animal models. For the first time, we report highly reproducible early morphological and molecular signatures of disease in heterozygous TSC+/− forebrain organoids, demonstrating the benefit of a scaled organoid system for phenotype discovery in human disease models.

ABSTRACT Omega-3 and omega-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) play critical roles in membrane stability and cell signaling within the retina. Elovl2 , an elongase involved in synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs), has recently been implicated in regulating aging in the mammalian retina. In this work, we characterize the expression and function of elovl2 in retina development in embryonic zebrafish. Whole mount in situ hybridization shows elovl2 is expressed in the Müller glia in embryonic and adult zebrafish. Lipidomics analysis of elovl2 crispants whole embryos at day 2 and eyes at day 7 demonstrated significant changes in lipids composition, especially on the level of lipids containing docosahexaenoic acid (DHA). Histological analysis of zebrafish lacking elovl2 revealed increased retinal thickness compared to controls at day 7 without gross disruptions of retinal architecture. Finally, elovl2 crispants showed differences in the visual motor reflex light off (VMR-OFF) at day 7 compared to controls. In sum, inactivation of elovl2 in zebrafish embryos caused changes in lipid composition and in visual behavior further confirming the important role of LC-PUFAs in healthy vision.

Optical coherence tomography (OCT) has gained wide adoption in biological and medical imaging due to its exceptional tissue penetration, 3D imaging speed and rich contrast. However, OCT plays a relatively small role in molecular and cellular imaging due to the lack of suitable biomolecular contrast agents. In particular, while the green fluorescent protein has provided revolutionary capabilities to fluorescence microscopy by connecting it to cellular functions such as gene expression, no equivalent reporter gene is currently available for OCT. Here we introduce gas vesicles, a unique class of naturally evolved gas-filled protein nanostructures, as the first genetically encodable OCT contrast agents. The differential refractive index of their gas compartments relative to surrounding aqueous tissue and their nanoscale motion enables gas vesicles to be detected by static and dynamic OCT at picomolar concentrations. Furthermore, the OCT contrast of gas vesicles can be selectively erased in situ with ultrasound, allowing unambiguous assignment of their location. In addition, gas vesicle clustering modulates their temporal signal, enabling the design of dynamic biosensors. We demonstrate the use of gas vesicles as reporter genes in bacterial colonies and as purified contrast agents in vivo in the mouse retina. Our results expand the utility of OCT as a unique photonic modality to image a wider variety of cellular and molecular processes.

Methylation of the regulatory region of the Elongation Of Very Long Chain Fatty Acids-Like 2 ( ELOVL2 ) gene, an enzyme involved in elongation of long-chain polyunsaturated fatty acids, is one of the most robust biomarkers of human age, but the critical question of whether ELOVL2 plays a functional role in molecular aging has not been resolved. Here, we report that Elovl2 regulates age-associated functional and anatomical aging in vivo , focusing on mouse retina, with direct relevance to age-related eye diseases. We show that an age-related decrease in Elovl2 expression is associated with increased DNA methylation of its promoter. Reversal of Elovl2 promoter hypermethylation in vivo through intravitreal injection of 5-Aza-2’-deoxycytidine (5-aza-dc) leads to increased Elovl2 expression and rescue of age-related decline in visual function. Mice carrying a point mutation C234W that disrupts Elovl2 -specific enzymatic activity show electrophysiological characteristics of premature visual decline, as well as early appearance of autofluorescent deposits, well-established markers of aging in the mouse retina. Finally, we find deposits underneath the retinal pigment epithelium in Elovl2 mutant mice, containing components of complement system and lipid metabolism. These findings indicate that ELOVL2 activity regulates aging in mouse retina, provide a molecular link between polyunsaturated fatty acids elongation and visual functions, and suggest novel therapeutic strategies for treatment of age-related eye diseases.