Abstract Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by SARS-CoV-2 infection presents with varied clinical manifestations 1 , ranging from mild symptoms to acute respiratory distress syndrome (ARDS) with high mortality 2,3 . Despite extensive analyses, there remains an urgent need to delineate immune cell states that contribute to mortality in severe COVID-19. We performed high-dimensional cellular and molecular profiling of blood and respiratory samples from critically ill COVID-19 patients to define immune cell genomic states that are predictive of outcome in severe COVID-19 disease. Critically ill patients admitted to the intensive care unit (ICU) manifested increased frequencies of inflammatory monocytes and plasmablasts that were also associated with ARDS not due to COVID-19. Single-cell RNAseq (scRNAseq)-based deconvolution of genomic states of peripheral immune cells revealed distinct gene modules that were associated with COVID-19 outcome. Notably, monocytes exhibited bifurcated genomic states, with expression of a cytokine gene module exemplified by CCL4 (MIP-1β) associated with survival and an interferon signaling module associated with death. These gene modules were correlated with higher levels of MIP-1β and CXCL10 levels in plasma, respectively. Monocytes expressing genes reflective of these divergent modules were also detectable in endotracheal aspirates. Machine learning algorithms identified the distinctive monocyte modules as part of a multivariate peripheral immune system state that was predictive of COVID-19 mortality. Follow-up analysis of the monocyte modules on ICU day 5 was consistent with bifurcated states that correlated with distinct inflammatory cytokines. Our data suggests a pivotal role for monocytes and their specific inflammatory genomic states in contributing to mortality in life-threatening COVID-19 disease and may facilitate discovery of new diagnostics and therapeutics.

Abstract People with the genetic disorder cystic fibrosis (CF) harbor lifelong respiratory infections, with morbidity and mortality frequently linked to chronic lung infections dominated by the opportunistically pathogenic bacterium Pseudomonas aeruginosa . During chronic CF lung infections, a single clone of P. aeruginosa can persist for decades and dominate end-stage CF lung disease due to its propensity to adaptively evolve to the respiratory environment, a process termed “pathoadaptation”. Chronic rhinosinusitis (CRS), chronic inflammation and infection of the sinonasal space, is highly prevalent in CF and the sinuses may serve as the first site in the respiratory tract to become colonized by bacteria that then proceed to seed lung infections. We identified three evolutionary genetic routes by which P. aeruginosa evolves in the sinuses of people with CF, including through the evolution of mutator lineages and proliferative insertion sequences and culminating in early genomic signatures of host-restriction. Our findings raise the question of whether a significant portion of the pathoadaptive phenotypes previously thought to have evolved in response to selective pressures in the CF lungs may have first arisen in the sinuses and underscore the link between sinonasal and lung disease in CF. Graphical abstract and highlights Pseudomonas aeruginosa undergoes adaptive evolution in the sinuses of people with CF Over time, pathoadapted strains display early signatures of genome degradation consistent with recent host restriction Mutations previously thought to occur in CF lungs may have first evolved in sinuses

Abstract Lymphopenia is common in severe COVID-19 disease, yet the mechanisms are poorly understood. In 148 patients with severe COVID-19, we found lymphopenia was associated with worse survival. CD4 + lymphopenia predominated, with lower CD4 + /CD8 + ratios in severe COVID-19 compared to recovered, mild disease (p<0.0001). In severe disease, immunodominant CD4 + T cell responses to Spike-1(S1) produced increased in vitro TNF-α, but impaired proliferation and increased susceptibility to activation-induced cell death (AICD). CD4 + TNF-α + T cell responses inversely correlated with absolute CD4 + counts from severe COVID-19 patients (n=76; R=-0.744, P<0.0001). TNF-α blockade including infliximab or anti-TNFRI antibodies strikingly rescued S1-specific CD4 + proliferation and abrogated S1-AICD in severe COVID-19 patients (P<0.001). Single-cell RNAseq demonstrated downregulation of Type-1 cytokines and NFκB signaling in S1-stimulated CD4 + cells with infliximab treatment. Lung CD4 + T cells in severe COVID-19 were reduced and produced higher TNF-α versus PBMC. Together, our findings show COVID-19-associated CD4 + lymphopenia and dysfunction is autocrine TNF-α/TNFRI-dependent and therapies targeting TNF-α may be beneficial in severe COVID-19. One Sentence Summary Autocrine TNF-α/TNFRI regulates CD4 + T cell lymphopenia and dysfunction in severe COVID-19 disease.

The role of the gut microbiome in critical illness is being actively investigated, but the optimal sampling methods for sequencing studies of gut microbiota remain unknown. Stool samples are generally considered reference-standard but are not practical to obtain in the intensive care unit (ICU), and thus, rectal swabs are often used. However, the reliability of rectal swabs for gut microbiome profiling has not been established in the ICU setting. In this study, we compared 16S rRNA gene sequencing results between rectal swab and stool samples collected at three timepoints in mechanically-ventilated critically-ill adults. Rectal swabs comprised 89% of samples collected at the baseline timepoint, but stool samples became more available at later time-points. Significant differences in alpha and beta-diversity between rectal swabs and stool samples were observed, but these differences were primarily due to baseline samples. Higher relative abundance of Actinobacteria phyla (typically skin microbes) was present in rectal swabs compared to stool samples (p=0.05), a difference that was attenuated over time. The progressive similarity of rectal swabs and stool samples likely results from increasing stool coating of the rectal vault and direct soiling of the rectal swabs taken at later time points. Therefore, inferences about the role of the gut microbiome in critical illness should be drawn cautiously and take into account the actual type and timing of samples analyzed.Statement of Importance Rectal swabs have been proposed as potential alternatives to stool samples for gut microbiome profiling in outpatients or healthy adults, but their reliability in critically-ill patients has not been defined. Because stool sampling is not practical and often not feasible in the intensive care unit, we performed a detailed comparison of gut microbial sequencing profiles between rectal swabs and stool samples in a longitudinal cohort of critically-ill patients. We identified systematic differences in gut microbial profiles between rectal swabs and stool samples and demonstrated that timing of rectal swab sampling had a significant impact on sequencing results. Our methodological findings should provide valuable information for the design and interpretation of future investigations of the role of the gut microbiome in critical illness.

Abstract Background Chronic rhinosinusitis (CRS) is a common, yet underreported and understudied manifestation of upper respiratory disease in people with cystic fibrosis (CF). There are currently no standard of care guidelines for the management of CF CRS, but treatment of upper airway disease may ameliorate lower airway disease. We sought to inform future treatment guidelines by determining whether changes to sinus microbial community diversity and specific taxa known to cause CF lung disease are associated with increased respiratory disease and inflammation. Methods We performed 16S rRNA gene sequencing, supplemented with cytokine analyses, microscopy, and bacterial culturing, on samples from the sinuses of 27 adults with CF CRS at the University of Pittsburgh’s CF Sinus Clinic. At each study visit, participants underwent endoscopic paranasal sinus sampling and clinical evaluation. We identified key drivers of microbial community composition and evaluated relationships between diversity and taxa with disease outcomes and inflammation. Findings Sinus community diversity was low and the composition was unstable, with many participants exhibiting alternating dominance between Pseudomonas aeruginosa and Staphylococci over time. Despite a tendency for dominance by these two taxa, communities were highly individualized and shifted composition during exacerbation of sinus disease symptoms. Exacerbations were also associated with communities dominated by Staphylococcus spp. Reduced microbial community diversity was linked to worse sinus disease and the inflammatory status of the sinuses (including increased IL-1 β ). Increased IL-1 β was also linked to worse sinus endoscopic appearance, and other cytokines were linked to microbial community dynamics. Interpretation To our knowledge, this is the largest longitudinal study of microbial communities and cytokine secretion in CF CRS. Our work revealed previously unknown instability of sinus microbial communities and a link between inflammation, lack of microbial community diversity, and worse sinus disease. Funding Cystic Fibrosis Foundation and US National Institutes of Health. Research in Context Evidence before this study A search of the PubMed database on October 11, 2021 with the terms [cystic fibrosis sinus microbiome] yielded 16 results, and we have identified seven primary research articles on the CF CRS microbiome (including re-analyses of existing datasets). Most are cross-sectional cohort analyses, along with one prior longitudinal study of four adults at the University of Auckland, New Zealand. Together, these prior studies reveal similarities between CF CRS and CF sputum microbiomes, including low community diversity associated with sinus disease, the presence of common CF-associated microbes in the sinuses, and prevalence of sinus communities dominated by P. aeruginosa or Staphylococcus aureus . High levels of IL-1 β are linked to the presence of nasal polyps in CF CRS, and polymorphisms in the IL-1 receptor antagonist gene are associated with risk of CRS outside of the context of CF. Two prior studies of this cohort have been performed by our laboratory. One describes clinical indicators of CF sinus disease and the other links sinus infection biogeography to P. aeruginosa evolutionary genomics. Added value of this study Our study is the first to examine longitudinal relationships between the host immune response (through cytokine profiling) and microbiota dynamics in CF CRS, including linking elevated IL-1 β to worse sinus disease through reduced sinus microbial community diversity. The longitudinal nature of our study also allowed us to uncover striking temporal instability of microbial communities in approximately half of our cohort’s sinus microbial communities over two years, including switching between communities dominated by P. aeruginosa and Staphylococcus spp. This instability could hinder attempts to link the relative abundance of taxa to clinical outcomes of interest in cross-sectional studies (e.g., markers of disease progression). We also identified patterns of synergy and antagonism between specific taxa, and impacts of the host immune response in the sinuses on community composition. Implications of all the available evidence Together with prior CF CRS microbiome studies, our study underscores similarities between sinus and lower respiratory tract microbial community structure in CF, and we show how community structure tracks with inflammation and several disease measures. This work strongly suggests that clinical management of CRS could be leveraged to improve overall respiratory health in CF. Our work implicates elevated IL-1 β in reduced microbiota diversity and worse sinus disease in CF CRS, suggesting applications for existing therapies targeting IL-1 β . Finally, the widespread use of highly effective CFTR modulator therapy has led to less frequent availability of spontaneous expectorated sputum for microbiological surveillance of lung infections. A better understanding of CF sinus microbiology could provide a much-needed alternative site for monitoring respiratory infection status by important CF pathogens.

Abstract While there have been extensive analyses characterizing cellular and humoral responses across the severity spectrum in COVID-19, predictors of outcomes within severe COVID-19 remain to be comprehensively elucidated. Recently, we identified divergent monocyte states as predictors of outcomes within severe COVID-19, but corresponding humoral profiles of risk have not been delineated. Furthermore, the nature of antibodies (Abs) directed against viral antigens beyond the spike protein or endemic coronavirus antigens and their associations with disease severity and outcomes remain poorly defined. We performed deep molecular profiling of Abs directed against a wide range of antigenic specificities in severe COVID-19 patients admitted to the ICU. The profiles consisted of canonical (S, RBD, N) and non-canonical (orf3a, orf8, nsp3, nps13 and M) antigenic specificities. Notably, multivariate machine learning (ML) models, generated using profiles of Abs directed against canonical or non-canonical antigens, were equally discriminative of recovery and mortality COVID-19 outcomes. In both ML models, survivors were associated with increased virus-specific IgA and IgG3 antibodies and with higher antigen-specific antibody galactosylation. Intriguingly, pre-pandemic healthy controls had cross-reactive Abs directed against nsp13 which is a conserved protein in other alpha and beta coronaviruses. Notably, higher levels of nsp13-specific IgA antibodies were associated with recovery in severe COVID-19. In keeping with these findings, a model built on Ab profiles for endemic coronavirus antigens was also predictive of COVID-19 outcome bifurcation, with higher levels of IgA and IgG3 antibodies against OC43 S and NL63 S being associated with survival. Our results suggest the importance of Abs targeting non-canonical SARS-CoV-2 antigens as well as those directed against endemic coronaviruses in favorable outcomes of severe COVID-19.