Understanding SARS-CoV-2 evolution and host immunity is critical to control COVID-19 pandemics. At the core is an arms-race between SARS-CoV-2 antibody and angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) recognition, a function of the viral protein spike. Mutations in spike impacting antibody and/or ACE2 binding are appearing worldwide, with the effect of mutation synergy still incompletely understood. We engineered 25 spike-pseudotyped lentiviruses containing individual and combined mutations, and confirmed that E484K evades antibody neutralization elicited by infection or vaccination, a capacity augmented when complemented by K417N and N501Y mutations. In silico analysis provided an explanation for E484K immune evasion. E484 frequently engages in interactions with antibodies but not with ACE2. Importantly, we identified a novel amino acid of concern, S494, which shares a similar pattern. Using the already circulating mutation S494P, we found that it reduces antibody neutralization of convalescent and post-immunization sera, particularly when combined with E484K and N501Y. Our analysis of synergic mutations provides a landscape for hotspots for immune evasion and for targets for therapies, vaccines and diagnostics.

Summary Multiple viral infections form biomolecular condensates in the host cell to compartmentalize viral reactions. Accumulating evidence indicates that these viral condensates may be hardened, a strategy with potential for exploitation as novel antiviral therapy, given that viral reactions rely on specific material properties for function. However, there is no molecular understanding on how to specifically and efficiently modify the material properties of viral condensates, a pre-requisite for overcoming off-target effects by rational drug design. In vitro , the material properties of biological condensates are modified by different thermodynamic parameters, including free energy, concentration, and type/strength of interactions. Here, we used influenza A virus liquid cytosolic condensates, A.K.A viral inclusions, to provide a proof of concept that modulating the type/strength of transient interactions among the interactome in IAV inclusions is more efficient at hardening these structures than varying the temperature or concentration, both in in vitro and in in vivo models. This stabilization can be achieved by a known pharmacological sticker that can specifically change the material properties of viral inclusions without affecting host proteome abundance nor solubility. Our work supports the development of antivirals targeting the material properties of biomolecular condensates in viral infections. It also provides a framework for the selection of compounds with this activity for general application and thus provides an advance in disease therapy.

Influenza A virus has an eight-partite RNA genome that during viral assembly forms a supramolecular complex containing one copy of each RNA. Genome assembly is a selective process driven by RNA-RNA interactions and is thought to lead to discrete punctate structures scattered through the cytosol. Here, we show that contrary to the accepted view, formation of these structures is not dependent on RNA-RNA interactions among distinct viral ribonucleoproteins (vRNPs), as they assemble in cells expressing only one vRNP type. We demonstrate that these viral inclusions display characteristics of liquid organelles, segregating from the cytosol without a delimitating membrane, dynamically exchanging material, deforming easily and adapting fast to hypotonic shock. We provide evidence that they develop close to the Endoplasmic Reticulum Exit Sites (ERES), being dependent on continuous ER-Golgi vesicular cycling. We show that viral inclusions do not promote escape to interferon response, and propose that they facilitate selected RNA-RNA interactions in a liquid environment of concentrated vRNPs.

Abstract Epidermal growth factor receptor (EGFR) signalling results in a variety of cell behaviours, including cell proliferation, migration and apoptosis, which depend on cell context. Here we have explored how the Rab5GEF, Rme-6, regulates EGFR signalling by modulating endocytic flux. We demonstrate that Rme-6, which acts early in the endocytic pathway, regulates EGFR trafficking through an endocytic compartment that is competent for ERK1/2 signalling. While overexpression of Rme-6 results in enhanced ERK1/2 nuclear localisation and c-Fos activation, loss of Rme-6 results in aberrant ERK1/2 signalling with increased cytoplasmic ERK1/2 phosphorylation (Thr202/Tyr204) but decreased ERK1/2 nuclear translocation and c-Fos activation, the latter leading to decreased cell proliferation. Phosphorylation of ERK1/2 by protein kinase 2 (CK2) is required for its nuclear translocation and our data support a model whereby Rme-6 provides a scaffold for a population of CK2 which is required for efficient nuclear translocation of ERK1/2. Rme-6 is itself a substrate for CK2 on Thr642 and Ser996 and phosphorylation on these sites can activate its Rab5GEF activity and endocytic trafficking of EGFR. Together our results indicate that Rme-6 co-ordinates EGFR trafficking and signalling to regulate the assembly and disassembly of an ERK1/2 signalosome. Summary statement Here we demonstrate how Rme-6, a Rab5GEF, co-ordinates trafficking and signalling of EGFR on the early endocytic pathway to ensure appropriate regulation of downstream ERK1/2 signalling.