Summary Protein degradation by proteasomes is important for the immune response against tumors. Antigens generated by the proteasome promote immune cell infiltration into tumors and improve tumors’ responses to immunotherapy. For example, immunoproteasomes – a subset of proteasomes induced by inflammatory signals – may improve the response of melanomas to immune checkpoint inhibitors (ICI) by eliciting tumor inflammation. Yet, it is unclear whether and how protein degradation by proteasomes impacts cancer progression and contributes to immune evasion and resistance. Here, we profile the proteasome-cleaved peptides in lung cancers and find that PSME4 serves as a novel inhibitory regulator of the immunoproteasome, playing an anti-inflammatory role in cancer. Biochemical assays combined with scRNA-seq, immunopeptidomics and in vivo analyses demonstrate that PSME4 promotes an immunosuppressive environment around the tumor and abrogates anti-tumor immunity by inhibiting antigen presentation and attenuating tumor inflammation. Furthermore, we find that PSME4 expression is correlated with responsiveness to ICI across several cancer types. Our findings suggest that PSME4-mediated regulation of proteasome activity is a novel mechanism of immune evasion in non-small-cell lung carcinoma and may be targeted therapeutically for restoring anti-tumor immunity. Graphical Abstract Highlights Mapping the degradation landscape in Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) uncovers altered proteasome activity and composition Proteasome regulator PSME4 plays an anti-inflammatory role in NSCLC by attenuating immunoproteasome activity PSME4 restricts tumor antigen presentation and cytokine secretion, defining a ‘cold’ tumor environment PSME4 drives tumor immune evasion and is associated with resistance to immunotherapy

Abstract During spermatogenesis, spermatogonia undergo a series of mitotic and meiotic divisions on their path to spermatozoa. To achieve this, a succession of processes requiring high proteolytic activity are in part orchestrated by the proteasome. The spermatoproteasome (s20S) is specific to the developing gametes, in which the gamete-specific α4s subunit replaces the α4 isoform found in the constitutive proteasome (c20S). Although the s20S is conserved across species and was shown to be crucial for germ cell development, its mechanism, function and structure remain incompletely characterized. Here, we used advanced mass spectrometry (MS) methods to map the composition of proteasome complexes and their interactomes throughout spermatogenesis. We observed that the s20S becomes highly activated as germ cells enter meiosis, mainly through a particularly extensive 19S activation and, to a lesser extent, PA200 binding. Additionally, the proteasome population shifts from c20S (98%) to s20S (>82-92%) during differentiation, presumably due to the shift from α4 to α4s expression. We demonstrated that s20S, but not c20S, interacts with components of the meiotic synaptonemal complex, where it may localize via association with the PI31 adaptor protein. In vitro, s20S preferentially binds to 19S, and displays higher trypsin- and chymotrypsin-like activities, both with and without PA200 activation. Moreover, using MS methods to monitor protein dynamics, we identified significant differences in domain flexibility between α4 and α4s. We propose that these differences induced by α4s incorporation result in significant changes in the way the s20S interacts with its partners, and dictate its role in germ cell differentiation.

Summary The 26S proteasome is a protease complex essential for proteostasis and strict regulation of diverse critical physiological processes, the mechanisms of which are still not fully described. The human 26S proteasome purification was optimized without exogenous nucleotides, to preserve the endogenous nucleotide occupancy and conformation of its AAA-ATPase subunits. This unveiled important effects on the proteasome function and structure resulting from exposure to Ca 2+ or Mg 2+ , with important physiological implications. This sample, with an added model degron designed to mimic the minimum canonical ubiquitin signal for proteasomal recognition, was analysed by high-resolution cryo-EM. Two proteasome conformations were resolved, with only one capable of degron binding. The structural data show that this occurs without major conformation rearrangements and allows to infer into the allosteric communication between ubiquitin degron binding and the peptidase activities. These results revise existing concepts on the 26S proteasome function and regulation, opening important opportunities for further research.