Abstract Motivation Large-scale kinetic models are an invaluable tool to understand the dynamic and adaptive responses of biological systems. The development and application of these models have been limited by the availability of computational tools to build and analyze large-scale models efficiently. The toolbox presented here provides the means to implement, parametrize and analyze large-scale kinetic models intuitively and efficiently. Results We present a Python package (SKiMpy) bridging this gap by implementing an efficient kinetic modeling toolbox for the semiautomatic generation and analysis of large-scale kinetic models for various biological domains such as signaling, gene expression, and metabolism. Furthermore, we demonstrate how this toolbox is used to parameterize kinetic models around a steady-state reference efficiently. Finally, we show how SKiMpy can imple-ment multispecies bioreactor simulations to assess biotechnological processes. Availability The software is available as a Python 3 package on GitHub: https://github.com/EPFL-LCSB/SKiMpy , along with adequate documentation. Contact vassily.hatzimanikatis@epfl.ch

Abstract Increased availability of multi-omics data has facilitated the characterization of metabolic phenotypes of cellular organisms. However, devising genetic interventions that drive cellular organisms toward the desired phenotype remains challenging in terms of time, cost, and resources. Kinetic models, in particular, hold great potential for accelerating this task since they can simulate the metabolic responses to environmental and genetic perturbations. Although the challenges in building kinetic models have been well-documented, there exists no consensus on how to use these models for strain design in a computationally tractable manner. A straightforward approach that exhaustively simulates and evaluates putative designs would be impractical, considering the intensive computational requirements when targeting multiple enzymes. We address this issue by introducing a framework to efficiently scout the space of designs while respecting the physiological requirements of the cell. The framework employs mixed-integer linear programming and nonlinear simulations with large-scale nonlinear kinetic models to devise genetic interventions in a scalable manner while accounting for the network effects of these perturbations. More importantly, the framework ensures the engineered strain’s robustness by maintaining its phenotype close to that of the reference strain. We use the framework to improve the production of anthranilate, a precursor for pharmaceutical drugs, in E. coli . The devised strategies include eight previously experimentally validated targets and also novel designs suitable for experimental implementation. As an essential part of the future design-build-test-learn cycles, we anticipate that this novel framework will enable high throughput designs and accelerated turnover in biotechnological processes.

Abstract Kinetic models of metabolic networks relate metabolic fluxes, metabolite concentrations, and enzyme levels through well-defined mechanistic relations rendering them an essential tool for systems biology studies aiming to capture and understand the behavior of living organisms. However, due to the lack of information about the kinetic properties of enzymes and the uncertainties associated with available experimental data, traditional kinetic modeling approaches often yield only a few or no kinetic models with desirable dynamical properties making the computational analysis unreliable and computationally inefficient. We present REKINDLE (REconstruction of KINetic models using Deep LEarning), a deep-learning-based framework for efficiently generating large-scale kinetic models with dynamic properties matching the ones observed in living organisms. We showcase REKINDLE’s efficiency and capabilities through three studies where we: (i) generate large populations of kinetic models that allow reliable in silico testing of hypotheses and systems biology designs, (ii) navigate the phenotypic space by leveraging the transfer learning capability of generative adversarial networks, demonstrating that the generators trained for one physiology can be fine-tuned for another physiology using a low amount of data, and (iii) expand upon existing datasets, making them amenable to thorough computational biology and data-science analyses. The results show that data-driven neural networks assimilate implicit kinetic knowledge and structure of metabolic networks and generate novel kinetic models with tailored properties and statistical diversity. We anticipate that our framework will advance our understanding of metabolism and accelerate future research in health, biotechnology, and systems and synthetic biology. REKINDLE is available as an open-access tool.

Many computational models for analyzing and predicting cell physiology rely on in vitro data, collected in dilute and cleanly controlled buffer solutions. However, this can mislead models because about 40% of the intracellular volume is occupied by a dense mixture of proteins, lipids, polysaccharides, RNA, and DNA. These intracellular macromolecules interact with enzymes and their reactants and affect the kinetics of biochemical reactions, making in vivo reactions considerably more complex than the in vitro data indicates. In this work, we present a new type of kinetics that captures and quantifies the effect of volume exclusion and any other spatial phenomena on the kinetics of elementary reactions. We further developed a framework that allows for the efficient parameterization of this type of kinetics using particle simulations. Our formulation, entitled GEneralized Elementary Kinetics (GEEK), can be used to analyze and predict the effect of intracellular crowding on enzymatic reactions and was herein applied to investigate the influence of crowding on phosphoglycerate mutase in Escherichia coli, which exhibits prototypical reversible Michaelis-Menten kinetics. Current research indicates that many enzymes are reaction limited and not diffusion limited, and our results suggest that the influence of fractal diffusion is minimal for these reaction-limited enzymes. Instead, increased association rates and decreased dissociation rates lead to a strong decrease in the effective maximal velocities 𝑉𝑚𝑎𝑥 and the effective Michaelis-Menten constants 𝐾𝑀 under physiologically relevant volume occupancies. Finally, the effects of crowding in the context of a linear pathway were explored, with the finding that crowding can have a redistributing effect, relative to ideal conditions, on the effective flux responses in the case of two-fold enzyme overexpression. We suggest that the presented framework in combination with detailed kinetics models will improve our understanding of enzyme reaction networks under non-ideal conditions.

Abstract Cells face competing metabolic demands. These include efficient use of both limited substrates and limited proteome capacity, as well as flexibility to deal with different environments. Flexibility requires spare enzyme capacity, which is proteome inefficient. ATP generation can occur via fermentation or respiration. Fermentation is much less substrate-efficient, but often assumed to be more proteome efficient 1–3 , thereby favoring fast-growing cells engaging in aerobic glycolysis 4–8 . Here, however, we show that mitochondrial respiration is actually more proteome-efficient than aerobic glycolysis. Instead, aerobic glycolysis arises from cells maintaining the flexibility to grow also anaerobically. These conclusions emerged from an unbiased assessment of metabolic regulatory mechanisms, integrating quantitative metabolomics, proteomics, and fluxomics, of two budding yeasts, Saccharomyces cerevisiae and Issatchenkia orientalis , the former more fermentative and the latter respiratory. Their energy pathway usage is largely explained by differences in proteome allocation. Each organism’s proteome allocation is remarkably stable across environmental conditions, with metabolic fluxes predominantly regulated at the level of metabolite concentrations. This leaves extensive spare biosynthetic capacity during slow growth and spare capacity of their preferred bioenergetic machinery when it is not essential. The greater proteome-efficiency of respiration is also observed in mammals, with aerobic glycolysis occurring in yeast or mammalian cells that maintain a fermentation-capable proteome conducive to both aerobic and anaerobic growth.

Abstract Understanding the dynamic responses of living cells upon genetic and environmental perturbations is crucial to decipher the metabolic functions of organisms. The rates of enzymatic reactions and their evolution are key to this understanding, as metabolic fluxes are limited by enzymatic activity. In this work, we investigate the optimal modes of operations for enzymes with regard that the evolutionary pressure drives enzyme kinetics toward increased catalytic efficiency. We use an efficient mixed-integer formulation to decipher the principles of optimal catalytic properties at various operating points. Our framework allows assessing the distribution of the thermodynamic forces and enzyme states, providing detailed insight into the mode of operation. Our results confirm earlier theoretical studies on the optimal kinetic design using a reversible Michaelis-Menten mechanism. The results further explored the optimal modes of operation for random-ordered multi-substrate mechanisms. We show that optimal enzyme utilization is achieved by unique or alternative modes of operations depending on the reactant’s concentrations. Our novel formulation allows investigating the optimal catalytic properties of all enzyme mechanisms with known elementary reactions. We propose that our novel framework provides the means to guide and evaluate directed evolution studies and estimate the limits of the direct evolution of enzymes.