SUMMARY The Arabidopsis transcription factor ABSCISIC ACID INSENSITIVE 4 (ABI4) is a key player in the plant hormone abscisic acid (ABA) signaling pathway. ABI4 is also involved in seed development and germination, the response to abiotic stresses such as drought and salinity, control of lipid reserve mobilization in the embryo, lateral root formation, and redox control. Expression of the ABI4 gene is tightly regulated and basal expression is low. Maximal transcript levels occur during seed maturation and in the early stages of seed germination and are markedly reduced in other developmental stages. ABI4 is an unstable lowly expressed protein, resulting from tight post-transcriptional regulation. Here, we studied factors affecting the stability of the ABI4 protein using transgenic Arabidopsis plants expressing 35S::HA-FLAG-ABI4-eGFP . Despite the expression of eGFP-tagged ABI4 being driven by the highly active 35S CaMV promoter the steady-state levels of ABI4 were extremely low in the roots of seedling grown in optimal conditions. These levels were markedly enhanced upon exposure of the seedlings to abiotic stress and ABA. ABI4 is degraded rapidly by the 26S proteasome and we report on the role of phosphorylation of ABI4-serine 114 in regulating ABI4 stability. Our results indicate that ABI4 is tightly regulated both post-transcriptionally and post-translationally. Moreover, abiotic factors and plant hormones have similar effects on ABI4 transcripts and ABI4 protein levels. This double-check mechanism for controlling ABI4 reflects on its central role in plant development and cellular metabolism. SIGNIFICANCE STATEMENT We show that stabilization of the ABI4 transcription factor by stress and hormones is mediated by phosphorylation of Serine 114 by MAP kinases. Transcription of ABI4 is also modulated by MAP kinases, suggesting that the same signals affect both transcript and protein levels, resulting in tight modulation of ABI4 activity.

The U-Box E3 ubiquitin ligase, AtPUB46, functions in the drought response: T-DNA insertion mutants of this single paralogous gene are hypersensitive to water- and oxidative stress (Adler et al. BMC Plant Biology 17:8, 2017). Here we analyze the phenotype of AtPUB46 overexpressing (OE) plants. AtPUB46-OE show increased tolerance to water stress and have smaller leaf blades and reduced stomatal pore size and stomatal index compared with wild type (WT). Despite this, the rate of water loss from detached rosettes is similar in AtPUB46-OE and WT plants. Germination of AtPUB46-OE seeds was less sensitive to salt than WT whereas seedling greening was more sensitive. We observed a complex response to oxidative stress applied by different agents: AtPUB46-OE plants were hypersensitive to H2O2 but hyposensitive to methyl viologen. AtPUB46-GFP fusion protein is cytoplasmic, however, in response to H2O2 a considerable proportion translocates to the nucleus. We conclude that the differential stress phenotype of the AtPUB46-OE does not result from its smaller leaf size or reduced stomata but from changes in the activity of a stress pathway regulated by a degradation substrate of the AtPUB46 E3.

Abstract The transcription factor ABA-INSENSITIVE(ABI)4 has diverse roles in regulating plant growth, including inhibiting germination and reserve mobilization in response to ABA and high salinity, inhibiting seedling growth in response to high sugars, inhibiting lateral root growth, and repressing light-induced gene expression. ABI4 activity is regulated at multiple levels, including gene expression, protein stability, and activation by phosphorylation. Although ABI4 can be phosphorylated at multiple residues by MAPKs, we found that S114 is the preferred site of MPK3. To examine the possible biological role of S114 phosphorylation, we transformed abi4-1 mutant plants with ABI4pro::ABI4 constructs encoding wild type (114S), phosphorylation-null (S114A) or phosphomimetic (S114E) forms of ABI4. Phosphorylation of S114 is necessary for the response to ABA, glucose, salt stress, and lateral root development, where the abi4 phenotype could be complemented by expressing ABI4(114S) or ABI4(S114E) but not ABI4(S114A). Comparison of root transcriptomes in ABA-treated roots of abi4-1 mutant plants transformed with constructs encoding the different phosphorylation-forms of S114 of ABI4 revealed that 85% of the ABI4-regulated genes whose expression pattern could be restored by expressing ABI4(114S) are down-regulated by ABI4. Over half of the ABI4-modulated genes were independent of the phosphorylation state of ABI4; these are enriched for stress responses. Phosphorylation of S114 was required for regulation of 35% of repressed genes, but only 17% of induced genes. The genes whose repression requires the phosphorylation of S114 are mainly involved in embryo and seedling development, growth and differentiation, and regulation of gene expression. Highlights Transcription factor ABI4 is a substrate of MAP kinases. MPK3 preferentially phosphorylates Serine 114 of ABI4. Phosphorylated Serine 114 of ABI4 is required for the complementation of abi4 mutants. Phosphorylated ABI4 acts primarily as a repressor.