Summary Long noncoding RNAs (lncRNAs) represent a multidimensional class of regulatory molecules involved in many aspects of brain function. Emerging evidence indicates that lncRNAs are expressed at the synapse; however, a direct role for their activity in this subcellular compartment in memory formation has yet to be demonstrated. Using lncRNA capture-seq on synaptosomes, we identified a significant number of lncRNAs that accumulate at synapses within the infralimbic prefrontal cortex of adult male C57/Bl6 mice. Among these is a splice variant related to the stress-associated lncRNA, Gas5. RNA immunoprecipitation followed by mass spectrometry and single molecule imaging revealed that this Gas5 isoform, in association with the RNA binding proteins G3bp2 and Caprin1, regulates the activity-dependent trafficking and clustering of RNA granules in dendrites. In addition, we found that cell-type-specific, state-dependent, and synapse-specific knockdown of the Gas5 variant led to impaired fear extinction memory. These findings identify a new mechanism of fear extinction that involves the dynamic interaction between local lncRNA activity and the coordination of RNA condensates in the synaptic compartment.

Abstract Circular RNAs (circRNAs) comprise a novel class of regulatory RNAs that are abundant in the brain, particularly within synapses. They are highly stable, dynamically regulated, and display a range of functional roles, including as decoys for miRNAs and proteins and, in some cases, translation. Early work in animal models revealed an association between circRNAs and neurodegenerative and neuropsychiatric disorders; however, relatively few studies have shown a causal link between circRNA function and memory. To address this knowledge gap, we sequenced circRNAs in the synaptosome compartment of the medial prefrontal cortex of fear extinction trained male C57BL/6J mice and found 12837 circRNAs enriched at the synapse, including Cdr1as . Targeted knockdown of Cdr1as in the neural processes of the infralimbic prefrontal cortex of male C57BL/6J mice led to impaired fear extinction memory. Altogether, our findings highlight the importance of localised circRNA activity at the synapse for memory formation and suggest that circRNAs may have a more widespread effect on brain function than previously thought.

RNA modification has recently emerged as an important mechanism underlying gene diversity linked to behavioral regulation. The conversion of adenosine to inosine by the ADAR family of enzymes is a particularly important RNA modification as it impacts the physiological readout of protein-coding genes. However, not all variants of ADAR appear to act solely on RNA. ADAR1 binds directly to DNA when it is in a non-canonical, left handed, Z conformation, but little is known about the functional relevance of this interaction. Here we report that ADAR1 binds to Z-DNA in an activity-dependent manner and that fear extinction learning leads to increased ADAR1 occupancy at DNA repetitive elements, with targets adopting a Z-DNA structure at sites of ADAR1 recruitment. Knockdown of ADAR1 leads to an inability to modify a previously acquired memory trace and this is associated with a concomitant change in DNA structure and a decrease in RNA editing. These findings suggest a novel mechanism of learning-induced gene regulation whereby ADAR1 physically interacts with Z-DNA in order to mediate its effect on RNA, and both are required for memory flexibility following fear extinction learning.

Abstract The conformational state of DNA fine-tunes the transcriptional rate and abundance of RNA. Here we report that DNA G-quadruplex (G4-DNA) accumulates in neurons in an experience-dependent manner, and that this is required for the transient silencing and activation of genes that are critically involved in learning and memory. In addition, site-specific resolution of G4-DNA by dCas9-mediated deposition of the helicase DHX36 impairs fear extinction memory. Dynamic DNA structure states therefore represent a key molecular mechanism underlying memory consolidation. One-Sentence Summary G4-DNA is a molecular switch that enables the temporal regulation of the gene expression underlying the formation of fear extinction memory.

ABSTRACT Long-noncoding RNA (lncRNA) comprise a new class of genes that have been assigned key roles in development and disease. Many lncRNAs are specifically transcribed in the brain where they regulate the expression of protein-coding genes that underpin neuronal function; however, their role in learning and memory remains largely unexplored. We used RNA Capture-Seq to identify a large population of lncRNAs that are expressed in the infralimbic cortex of adult male mice in response to fear-related learning, with 14.5% of these annotated in the GENCODE database as lncRNAs with no known function. We combined these data with cell-type-specific ATAC-seq on neurons that had been selectively activated by fear-extinction learning, and revealed 434 lncRNAs derived from enhancer regions in the vicinity of protein-coding genes. In particular, we discovered an experience-induced lncRNA called ADRAM that acts as both a scaffold and a combinatorial guide to recruit the brain-enriched chaperone protein 14-3-3 to the promoter of the memory-associated immediate early gene Nr4a2. This leads to the expulsion of histone deactylases 3 and 4, and the recruitment of the histone acetyltransferase creb binding protein, which drives learning-induced Nr4a2 expression. Knockdown of ADRAM disrupts this interaction, blocks the expression of Nr4a2, and ultimately impairs the formation of fear-extinction memory. This study expands the lexicon of experience-dependent lncRNA activity in the brain, highlights enhancer-derived RNAs (eRNAs) as key players in the epigenetic regulation of gene expression associated with fear extinction, and suggests eRNAs, such as ADRAM, may constitute viable targets in developing novel treatments for fear-related anxiety disorders.

The RNA modification N6-methyladenosine (m6A) is critically involved in the regulation of gene activity underlying experience-dependent plasticity, and is necessary for the functional interplay between RNA and RNA binding proteins (RBPs) in the nucleus. However, the complete repertoire of m6A-modified RNA interacting RBPs in the synaptic compartment, and whether they are involved in fear extinction, have yet to be revealed. Using RNA immunoprecipitation followed by mass spectrometry, we discovered 12 novel, synapse-specific, learning-induced m6A readers in the medial prefrontal cortex of male C57/B6 mice. m6A RNA-sequencing also revealed a unique population of learning-related m6A-modified RNAs at the synapse, which includes a variant of the long non-coding RNA (lncRNA) metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (Malat1). m6A-modified Malat1 binds to a subset of novel m6A readers, including cytoplasmic FMR1 interacting protein 2 (CYFIP2) and dihydropyrimidase-related protein 2 (DPYSL2) and a cell-type-specific, state-dependent, and synapse-specific reduction in m6A-modified Malat1 disrupts the interaction between Malat1 and DPYSL2 and impairs fear extinction. The consolidation of fear-extinction memory therefore relies on an interaction between m6A-modified Malat1 and select RBPs in the synaptic compartment.

Summary Regulatory functions of lncRNAs in neurons have been majorly limited to the nucleus. The identity of synaptic lncRNAs and their functional role associated with synapse development and memory are poorly understood. We employed RNA-seq analysis of synaptoneurosomes to identify 94 synapse-enriched lncRNAs from the mouse hippocampus. We find Pvt1 to be a specific regulator of excitatory, but not inhibitory, synapse development in vivo . RNA-Seq from Pvt1 knockdown neurons identified down-regulated transcripts encoding pre- and post-synaptic proteins influencing synapse formation. This observation is congruent with reduction in mEPSC amplitude and frequency. We find a synapse-centric role for SynLAMP which is specifically transported to the synaptic compartment upon contextual fear conditioning (CFC) and regulate activity-dependent dendritic translation. CFC led to enhancement of interaction between SynLAMP and the translation repressor FUS, indicating SynLAMP to be a molecular decoy. SynLAMP RNAi partially occludes fear memory, suggesting an input-specific role of lncRNAs at the synapse.