ABSTRACT The sequence content of the 3′ UTRs of many mRNA transcripts is regulated through alternative polyadenylation (APA). The study of this process using RNAseq data, though, has been historically challenging. To combat this problem, we developed LABRAT, an APA quantification method. LABRAT takes advantage of newly developed transcriptome quantification techniques to accurately determine relative APA site usage and how it varies across conditions. Using LABRAT, we found consistent relationships between gene-distal APA and subcellular RNA localization in multiple cell types. We also observed connections between transcription speed and APA site choice as well as tumor-specific transcriptome-wide shifts in APA in hundreds of patient-derived tumor samples that were associated with patient prognosis. We investigated the effects of APA on transcript expression and found a weak overall relationship, although many individual genes showed strong correlations between APA and expression. We interrogated the roles of 191 RNA-binding proteins in the regulation of APA, finding that dozens promote broad, directional shifts in relative APA isoform abundance both in vitro and in patient-derived samples. Finally, we find that APA site shifts in the two classes of APA, tandem UTRs and alternative last exons, are strongly correlated across many contexts, suggesting that they are coregulated.

ABSTRACT RNA molecules are localized to specific subcellular regions through interactions between RNA regulatory elements and RNA binding proteins (RBPs). Generally, our knowledge of the mechanistic details behind the localization of a given RNA is restricted to a particular cell type. Here, we show that RNA/RBP interactions that regulate RNA localization in one cell type predictably regulate localization in other cell types with vastly different morphologies. To determine transcriptome-wide RNA spatial distributions across the apicobasal axis of human intestinal epithelial cells, we used our recently developed RNA proximity labeling technique, Halo-seq. We found that mRNAs encoding ribosomal proteins (RP mRNAs) were strongly localized to the basal pole of these cells. Using reporter transcripts and single molecule RNA FISH, we found that pyrimidine-rich TOP motifs in the 5′ UTRs of RP mRNAs were sufficient to drive basal RNA localization. Interestingly, the same TOP motifs were also sufficient to drive RNA localization to the neurites of mouse neuronal cells. In both cell types, the regulatory activity of the TOP motif was dependent on it being at the extreme 5′ end of the transcript, was abolished upon perturbation of the TOP-binding protein LARP1, and was reduced upon inhibition of kinesins. To extend these findings, we compared subcellular RNAseq data from neuronal and epithelial cells. We found that the basal compartment of epithelial cells and the projections of neuronal cells were enriched for highly similar sets of RNAs, indicating that broadly similar mechanisms may be transporting RNAs in both cell types. These findings identify the first RNA element known to regulate RNA localization across the apicobasal axis of epithelial cells, establish LARP1 as an RNA localization regulator, and demonstrate that RNA localization mechanisms cut across cell morphologies.

ABSTRACT Thousands of RNA species display nonuniform distribution within cells. However, quantification of the spatial patterns adopted by individual RNAs remains difficult, in part by a lack of quantitative tools for subcellular transcriptome analysis. In this study, we describe an RNA proximity labeling method that facilitates the quantification of subcellular RNA populations with high spatial specificity. This method, termed Halo-seq, pairs a light-activatable, radical generating small molecule with highly efficient Click chemistry to efficiently label and purify spatially defined RNA samples. We compared Halo-seq with previously reported similar methods and found that Halo-seq displayed a higher efficiency of RNA labeling, indicating that it is well suited to the investigation of small, precisely localized RNA populations. We then used Halo-seq to quantify nuclear, nucleolar, and cytoplasmic transcriptomes, characterize their dynamic nature following perturbation, and identify RNA sequence features associated with their composition. Specifically, we found that RNAs containing AU-rich elements are relatively enriched in the nucleus. This enrichment becomes stronger upon treatment with the nuclear export inhibitor leptomycin B, both expanding the role of HuR in RNA export and generating a comprehensive set of transcripts whose export from the nucleus depends on HuR.

Abstract ELAV/Hu factors are conserved RNA binding proteins that play diverse roles in mRNA processing and regulation. The founding member, Drosophila Elav, was recognized as a vital neural factor 35 years ago. Nevertheless, still little is known about its impacts on the transcriptome, and potential functional overlap with its paralogs. Building on our recent findings that neural-specific lengthened 3’ UTR isoforms are co-determined by ELAV/Hu factors, we address their impacts on splicing. In ectopic contexts, all three members (Elav, Fne and Rbp9) induce similar and broad changes to cassette exon and alternative last exon (ALE) splicing. Reciprocally, double mutants of elav/fne , but not elav alone, have opposite effects on both types of mRNA processing events in the larval CNS. Accordingly, while fne mutants are normal, fne loss strongly enhances elav mutants with respect to neuronal differentiation. While manipulation of Drosophila ELAV/Hu factors induces both exon skipping and inclusion, motif analysis indicates their major direct effects are to suppress cassette exon usage. Moreover, we find direct analogies in their roles in global promotion of distal ALE splicing and terminal 3’ UTR extension, since both involve local suppression of proximal polyadenylation signals via ELAV/Hu binding sites downstream of cleavage sites. Finally, we provide evidence for analogous co-implementation of distal ALE and APA lengthening programs in mammalian neurons, linked to ELAV/Hu motifs downstream of regulated polyadenylation sites. Overall, ELAV/Hu proteins orchestrate multiple conserved programs of neuronal mRNA processing by suppressing alternative exons and polyadenylation sites.

Abstract Midbodies (MBs) have been shown to function during telophase as a recruiting hub, especially for ESCRT-III complex subunits, to regulate the abscission step of cytokinesis. However, the molecular machinery governing specific protein targeting and activation at the MB remains poorly understood. Until recently, it was thought that abscission regulating proteins, such as ESCRT-III complex subunits, accumulate at the MB by directly or indirectly binding to the MB resident protein, CEP55. However, recent studies have shown that depletion of CEP55 does not fully block ESCRT-III targeting to the MB, and cells in CEP55 knock-out mice divide normally. Additionally, since MBs are microtubule-rich, proteinaceous structures, it is conceptually hard to imagine how large protein complexes, such as the ESCRT-III complex, can successfully diffuse into the MB from the cytosol in a rapid and highly regulated manner. Here, we show that MBs contain mRNAs and that these MB-associated mRNAs can be locally translated, resulting in the accumulation of abscission-regulating proteins. We also demonstrate that localized MB-associated translation of CHMP4B is required for its targeting to the abscission site and that 3′ UTR-dependent CHMP4B mRNA targeting to the MB is required for successful completion of cytokinesis. Finally, we identify regulatory cis -elements within RNAs that are necessary and sufficient for mRNA trafficking to the MB. Based on all this data, we propose a novel method of regulating cytokinesis and abscission by MB-associated targeting and localized translation of selective mRNAs.

The sorting of RNA molecules to distinct subcellular locations facilitates the activity of spatially restricted processes through local protein synthesis. This process affects thousands of transcripts yet precisely how these RNAs are trafficked to their destinations remains generally unclear. Here we have analyzed subcellular transcriptomes of FMRP-null mouse neuronal cells to identify transcripts that depend on FMRP for efficient transport to neurites. We found that these FMRP RNA localization targets contain a large enrichment of G-quadruplex sequences, particularly in their 3′ UTRs, suggesting that FMRP recognizes these sequences to promote the localization of transcripts that contain them. Fractionation of neurons derived from human Fragile X Syndrome patients revealed a high degree of conservation in the identity of FMRP localization targets between human and mouse as well as an enrichment of G-quadruplex sequences in human FMRP RNA localization targets. Using high-throughput RNA/protein interaction assays and single-molecule RNA FISH, we identified the RGG domain of FMRP as important for both interaction with G-quadruplex RNA sequences and the neuronal transport of G-quadruplex-containing transcripts. Finally, we used ribosome footprinting to identify translational regulatory targets of FMRP. The translational regulatory targets were not enriched for G-quadruplex sequences and were largely distinct from the RNA localization targets of FMRP, indicating that the two functions can be biochemically separated and are mediated through different target recognition mechanisms. These results establish a molecular mechanism underlying FMRP-mediated neuronal RNA localization and provide a framework for the elucidation of similar mechanisms governed by other RNA-binding proteins.