ABSTRACT The spatial segregation of pericentromeric heterochromatin (PCH) into distinct, membrane-less nuclear compartments involves the binding of Heterochromatin Protein 1 (HP1) to H3K9me2/3-rich genomic regions. While HP1 exhibits liquid-liquid phase separation properties in vitro , its mechanistic impact on the structure and dynamics of PCH condensate formation in vivo remains largely unresolved. Here, using biophysical modeling, we systematically investigate the mutual coupling between self-interacting HP1-like molecules and the chromatin polymer. We reveal that the specific affinity of HP1 for H3K9me2/3 loci facilitates coacervation in nucleo , and promotes the formation of stable PCH condensates at HP1 levels far below the concentration required to observe phase separation in purified protein assays in vitro . These heterotypic HP1-chromatin interactions give rise to a strong dependence of the nucleoplasmic HP1 density on HP1-H3K9me2/3 stoichiometry, consistent with the thermodynamics of multicomponent phase separation. The dynamical crosstalk between HP1 and the viscoelastic chromatin scaffold also leads to anomalously-slow equilibration kinetics, which strongly depend on the genomic distribution of H3K9me2/3 domains, and result in the coexistence of multiple long-lived, microphase-separated PCH compartments. The morphology of these complex coacervates is further found to be governed by the dynamic establishment of the underlying H3K9me2/3 landscape, which may drive their increasingly abnormal, aspherical shapes during cell development. These findings compare favorably to 4D microscopy measurements of HP1 condensates that we perform in live Drosophila embryos, and suggest a general quantitative model of PCH formation based on the interplay between HP1-based phase separation and chromatin polymer mechanics. SIGNIFICANCE STATEMENT The compartmentalization of pericentromeric heterochromatin (PCH), the highly-repetitive part of the genome, into membrane-less organelles enriched in HP1 proteins, is critical to both genetic stability and cell fate determination. While HP1 can self-organize into liquid-like condensates in vitro , the roles of HP1 and the polymer chromatin in forming 3D PCH domains in vivo are still unclear. Using molecular simulations, we show that key kinetic and thermodynamic features of PCH condensates are consistent with a phase-separation mode of organization driven by the genomic distribution of methylated domains and HP1 self-attraction and affinity for heterochromatin. Our predictions are corroborated by live-microscopy performed during early fly embryogenesis, suggesting that a strong crosstalk between HP1-based phase separation and chromosome mechanics drive PCH condensate formation.

In mammals HP1-mediated heterochromatin forms positionally and mechanically stable genomic domains even though the component HP1 paralogs, HP1 α , HP1 β , and HP1 γ , display rapid on-off dynamics. Here we investigate whether phase-separation by HP1 proteins can explain these biological observations. Using bulk and single-molecule methods, we show that, within phase-separated HP1 α -DNA condensates, HP1 α acts as a dynamic liquid, while compacted DNA molecules are constrained in local territories. These condensates are resistant to large forces yet can be readily dissolved by HP1 β . Finally, we find that differences in each HP1 paralog’s DNA compaction and phase-separation properties arise from their respective disordered regions. Our findings suggest a generalizable model for genome organization in which a pool of weakly bound proteins collectively capitalize on the polymer properties of DNA to produce self-organizing domains that are simultaneously resistant to large forces at the mesoscale and susceptible to competition at the molecular scale.

Abstract We recently developed Di rected Me thylation with Lo ng-read seq uencing (DiMeLo-seq) to map protein-DNA interactions genome wide. DiMeLo-seq is capable of mapping multiple interaction sites on single DNA molecules, profiling protein binding in the context of endogenous DNA methylation, identifying haplotype specific protein-DNA interactions, and mapping protein-DNA interactions in repetitive regions of the genome that are difficult to study with short-read methods. With DiMeLo-seq, adenines in the vicinity of a protein of interest are methylated in situ by tethering the Hia5 methyltransferase to an antibody using protein A. Protein-DNA interactions are then detected by direct readout of adenine methylation with long-read, single-molecule, DNA sequencing platforms such as Nanopore sequencing. Here, we present a detailed protocol and practical guidance for performing DiMeLo-seq. This protocol can be run on nuclei from fresh, lightly fixed, or frozen cells. The protocol requires 1-2 days for performing in situ targeted methylation, 1-5 days for library preparation depending on desired fragment length, and 1-3 days for Nanopore sequencing depending on desired sequencing depth. The protocol requires basic molecular biology skills and equipment, as well as access to a Nanopore sequencer. We also provide a Python package, dimelo , for analysis of DiMeLo-seq data. Key papers Altemose, N., Maslan, A., Smith, O.K., Sundararajan, K., Brown, R.R., Mishra, R., Detweiler, A.M., Neff, N., Miga, K.H., Straight, A.F. and Streets, A., 2022. DiMeLo-seq: a long-read, single-molecule method for mapping protein–DNA interactions genome wide. Nature Methods , pp.1-13. ( https://doi.org/10.1038/s41592-022-01475-6 )