Abstract Aneuploidy compromises genomic stability, often leading to embryo inviability, and is frequently associated with tumorigenesis and aging. Different aneuploid chromosome stoichiometries lead to distinct transcriptomic and phenotypic changes, making it helpful to study aneuploidy in tightly controlled genetic backgrounds. By deploying the engineered SCRaMbLE system to the newly synthesized Sc2.0 megabase chromosome VII ( synVII ), we constructed a synthetic disomic yeast and screened hundreds of SCRaMbLEd derivatives with diverse chromosomal rearrangements. Phenotypic characterization and multi-omics analysis revealed that fitness defects associated with aneuploidy could be restored by i) removing most of the chromosome content, or ii) modifying specific regions in the duplicated chromosome. These findings indicate that both chromosome copy number and chromosomal regions contribute to the aneuploidy-related phenotypes, and the synthetic yeast resource opens new paradigms in studying aneuploidy. In brief Use of SCRaMbLE and newly synthesized Mb-scale Sc2.0 chromosome VII enables insights into genotype/phenotype relationships associated with aneuploidy Highlights De novo design and synthesis of a Mb-scale synthetic yeast chromosome VII, carrying 11.8% sequence modifications and representing nearly 10% of the yeast genome. A disomic yeast (n + synVII ) is constructed for dissecting the aneuploidy phenotype SCRaMbLE enables systematic exploration of regions causing aneuploidy phenotypes Chromosomal copy number and content both contribute to aneuploidy phenotypes A 20 Kb deletion on the right arm of synVII leads to fitness improvement linked to up-regulation of protein synthesis

SUMMARY The genome of an organism is inherited from its ancestor and keeps evolving over time, however, how much the current version could be altered remains unknown. Here, we use the left arm of chromosome XII ( chrXIIL ) as an example to probe the genome plasticity in Saccharomyces cerevisiae . A neochromosome was designed to harbor originally dispersed genes. The essentiality of sequences in chrXIIL was dissected by targeted DNA removal, chromosome truncation and random deletion. Notably, 12 genes were sufficient for survival, while 25 genes are required to retain robust fitness. Next, we demonstrated these genes could be reconstructed using synthetic regulatory sequences and recoded open-reading frames with “one-amino-acid-one-codon” strategy. Finally, we built a neochromsome, which could substitute for chrXIIL for cell viability, with these reconstructed genes. Our work not only highlights the high plasticity of yeast genome, but also illustrates the possibility of making functional chromosomes with completely artificial sequences. HIGHLIGHTS A neochromosome was designed to facilitate the assembly of exogenous DNA for stable expression in yeast The left arm of chrXII could be minimized to just 12 genes to maintain viability, but additional genes were required to retain robust fitness Comprehensive recoding and transcriptional refactoring using artificial regulatory sequences produced a functional chromosome arm A completely reconstructed neochromosome could replace the chrXIIL to maintain comparable fitness

Summary In eukaryotic genomes, ribosomal DNA (rDNA) generally resides as a highly repetitive and dynamic structure, making it difficult to study. Here, a synthetic rDNA array on chromosome III in budding yeast was constructed to serve as the sole source of rRNA. Utilizing the loxPsym site within each rDNA repeat and the Cre recombinase, we were able to reduce the copy number to as few as eight copies. Additionally, we constructed strains with two or three rDNA arrays, and found that the presence of multiple arrays did not affect the formation of a single nucleolus. Although alteration on the position and number of rDNA arrays did impact three-dimensional genome structure, the additional rDNA arrays had no deleterious influence on cell growth or transcriptomes. Together, this study sheds light on the high plasticity of rDNA organization and opens up opportunities for future rDNA engineering. Highlights A method was established for efficient construction of synthetic rDNA arrays in budding yeast The rDNA repeats in a haploid yeast can be reduced to as few as eight copies to support cell viability Yeast cells with two or three DNA arrays on distinct chromosomes form a single nucleolus. Dispersed rDNA arrays result in no deleterious influence on cell growth or transcriptomes.