Designing prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spike is critical for the effectiveness of COVID-19 vaccines. All COVID-19 vaccines in the US encode spike with K986P/V987P mutations to stabilize its prefusion conformation. However, contemporary methods on engineering prefusion-stabilized spike immunogens involve tedious experimental work and heavily rely on structural information. Here, we established a systematic and unbiased method of identifying mutations that concomitantly improve expression and stabilize the prefusion conformation of the SARS-CoV-2 spike. Our method integrated a fluorescence-based fusion assay, mammalian cell display technology, and deep mutational scanning. As a proof-of-concept, this method was applied to a region in the S2 domain that includes the first heptad repeat and central helix. Our results revealed that besides K986P and V987P, several mutations simultaneously improved expression and significantly lowered the fusogenicity of the spike. As prefusion stabilization is a common challenge for viral immunogen design, this work will help accelerate vaccine development against different viruses.

Abstract Double-stranded DNA (dsDNA) viruses package their genetic material into protein cages with diameters usually a few hundred times smaller than the length of their genome. Compressing the relatively stiff and highly negatively charged dsDNA into a small volume is energetically costly and mechanistically enigmatic. Multiple models of dsDNA packaging have been proposed based on various experimental evidence and simulation methods, but direct observation of any viral genome organization is lacking. Here, using cryoET and an improved data processing scheme that utilizes information from the encaging protein shell, we present 3D views of dsDNA genome inside individual viral particles at resolution that densities of neighboring DNA duplexes are readily separable. These cryoET observations reveal a “rod-and-coil” fold of the dsDNA that is conserved among herpes simplex virus type 1 (HSV-1) with a spherical capsid, bacteriophage T4 with a prolate capsid, and bacteriophage T7 with a proteinaceous core inside the capsid. Finally, inspired by the genome arrangement in partially packaged T4 particles, we propose a mechanism for the genome packaging process in dsDNA viruses.