Abstract Surface layers (S-layers) are resilient two-dimensional protein lattices that encapsulate many bacteria and most archaea. In archaea, S-layers usually form the only structural component of the cell wall and thus act as the final frontier between the cell and its environment. Therefore, S-layers are crucial for supporting microbial life. Notwithstanding their importance, little is known about archaeal S-layers at the atomic level. Here, we combined single particle cryo electron microscopy (cryoEM), cryo electron tomography (cryoET) and Alphafold2 predictions to generate an atomic model of the two-component S-layer of Sulfolobus acidocaldarius . The outer component of this S-layer (SlaA) is a flexible, highly glycosylated, and stable protein. Together with the inner and membrane-bound component (SlaB), they assemble into a porous and interwoven lattice. We hypothesize that jackknife-like conformational changes, as well as pH-induced alterations in the surface charge of SlaA, play important roles in S-layer assembly.

SUMMARY The outer-membrane of Gram-negative bacteria is critical for surface adhesion, pathogenicity, antibiotic resistance and survival. The major constituent – hydrophobic β-barrel O uter- M embrane P roteins (OMPs) – are secreted across the inner-membrane through the Sec-translocon for delivery to periplasmic chaperones e.g. SurA, which prevent aggregation. OMPs are then offloaded to the β- B arrel A ssembly M achinery (BAM) in the outer-membrane for insertion and folding. We show the H olo- T rans L ocon (HTL: an assembly of the protein-channel core-complex SecYEG, the ancillary sub-complex SecDF, and the membrane ‘insertase’ YidC) contacts SurA and BAM through periplasmic domains of SecDF and YidC, ensuring efficient OMP maturation. Our results show the trans-membrane proton-motive-force (PMF) acts at distinct stages of protein secretion: for SecA-driven translocation across the inner-membrane through SecYEG; and to communicate conformational changes via SecDF to the BAM machinery. The latter presumably ensures efficient passage of OMPs. These interactions provide insights of inter-membrane organisation, the importance of which is becoming increasingly apparent.

Abstract Amongst the major types of archaeal filaments, several have been shown to closely resemble bacterial homologues of the Type IV pili (T4P). Within Sulfolobales , member species encode for three types of T4P, namely the archaellum, the UV-inducible pilus system (Ups) and the archaeal adhesive pilus (Aap). Whereas the archaellum functions primarily in swimming motility, and the Ups in UV-induced cell aggregation and DNA-exchange, the Aap plays an important role in adhesion and twitching motility. Here, we present a cryoEM structure of the Aap of the archaeal model organism Sulfolobus acidocaldarius . We identify the component subunit as AapB and find that while its structure follows the canonical T4P blueprint, it adopts three distinct conformations within the pilus. The tri-conformer Aap structure that we describe challenges our current understanding of pilus structure and sheds new light on the principles of twitching motility.

Abstract Amongst the major archaeal filament types, several have been shown to closely resemble bacterial homologues of the Type IV pili (T4P). Within Sulfolobales, member species encode for three types of T4P, namely the archaellum, the UV-inducible pilus (Uvp) and the archaeal adhesive pilus (Aap). Whereas the archaellum functions primarily in swimming motility, and the Uvp in UV-induced cell aggregation and DNA-exchange, the Aap plays an important role in adhesion and twitching motility. All previously solved Aap appear to have almost identical helical structures. Here, we present a cryoEM structure of the Aap of the archaeal model organism Sulfolobus acidocaldarius. We identify the component subunit as AapB and find that while its structure follows the canonical T4P blueprint, it adopts three distinct conformations within the pilus. The tri-conformer Aap structure that we describe challenges our current understanding of pilus structure and sheds new light on the principles of twitching motility.

Abstract Translational control is an essential process for the cell to adapt to varying physiological or environmental conditions. To survive adverse conditions such as low nutrient levels, translation can be shut down almost entirely by inhibiting ribosomal function. Here we investigated eukaryotic hibernating ribosomes from the microsporidian parasite Spraguea lophii in situ by a combination of cryo-electron tomography (cryoET) and single particle cryoEM. We show that microsporidian spores contain ribosomes primed for host cell invasion and thus shed new light on the infection mechanism of this important pathogen. Prior to host infection, virtually all ribosomes are locked in the 100 S dimeric state, which appears to be formed by a unique dimerization mechanism that is distinct from its bacterial counterparts. Within the dimer, the hibernation factor MDF1 is bound within the E site, locking the L1 stalk in a closed conformation, and thus preventing the translation of mRNAs to polypeptides.

Abstract Pili are ubiquitous filamentous surface extensions that play crucial roles for bacterial and archaeal cellular processes such as adhesion, biofilm formation, motility, cell-cell communication, DNA uptake and horizontal gene transfer to name a few. Here we report on the discovery and structure of the archaeal thread – a remarkably stable archaeal pilus that belongs to a so-far largely unknown class of protein filaments. We find that the filament is highly glycosylated and interconnected via donor strand complementation, as well as isopeptide bonds, reminiscent of bacterial type I pili. Despite striking structural similarity with bacterial type-1 pili, archaeal threads appear to have evolved independently and are likely assembled by a markedly distinct mechanism.

ABSTRACT Gram-negative bacteria are surrounded by two protein-rich membranes with a peptidoglycan layer sandwiched between them. Together they form the envelope (or cell wall), crucial for energy production, lipid biosynthesis, structural integrity, and for protection against the physical and chemical environmental challenges. To achieve envelope biogenesis, periplasmic and outer-membrane proteins (OMPs) must be transported from the cytosol and through the inner-membrane, via the ubiquitous SecYEG protein-channel. Emergent proteins either fold in the periplasm or cross the peptidoglycan (PG) layer towards the outer-membrane for insertion through the β-barrel assembly machinery (BAM). Trafficking of hydrophobic proteins through the periplasm is particularly treacherous given the high protein density and the absence of energy (ATP or chemiosmotic potential). Numerous molecular chaperones assist in the prevention and recovery from aggregation, and of these SurA is known to interact with BAM, facilitating delivery to the outer-membrane. However, it is unclear how proteins emerging from the Sec-machinery are received and protected from aggregation and proteolysis prior to an interaction with SurA. Through biochemical analysis and electron microscopy we demonstrate the binding capabilities of the unoccupied and substrate-engaged SurA to the inner-membrane translocation machinery complex of SecYEG-SecDF-YidC – aka the holo-translocon (HTL). Supported by AlphaFold predictions, we suggest a role for periplasmic domains of SecDF in chaperone recruitment to the protein translocation exit site in SecYEG. We propose that this immediate interaction with a recruited chaperone helps to prevent aggregation and degradation of nascent envelope proteins, facilitating their safe passage to the periplasm and outer-membrane.

Abstract Archaea swim by means of a unique molecular machine called the archaellum. The archaellum consists of an ATP-powered intracellular motor that drives the rotation of an extracellular filament, allowing the cell to rapidly propel itself through liquid media. The archaellum filament comprises multiple copies of helically organised subunits named archaellins. While in many species several archaellin homologs are encoded in the same operon, structural studies conducted to date have suggested that archaella consist of only one protein species. Thus, the role of the remaining archaellin genes remains elusive. Here we present the structure of the Methanocaldococcus villosus archaellum filament at 3.08 Å resolution. We find that the filament is composed of two alternating archaellins - ArlB1 and ArlB2, suggesting that the architecture and assembly of archaella is more complex than previously thought. Moreover, we identify two major structural elements that enable the archaellum filament to move. Our findings provide new insights into archaeal motility and challenge the current view on the archaellum architecture and assembly.

Abstract The Ff family of filamentous bacteriophages infect gram-negative bacteria, but do not cause lysis of their host cell. Instead, new virions are extruded via the phage-encoded pIV protein, which has homology with bacterial secretins. Here, we determine the structure of pIV from the f1 filamentous bacteriophage at 2.7 Å resolution by cryo-electron microscopy, the first near-atomic structure of a phage secretin. Fifteen f1 pIV subunits assemble to form a gated channel in the bacterial outer membrane, with associated soluble domains projecting into the periplasm. We model channel opening and propose a mechanism for phage egress. By single-cell microfluidics experiments, we demonstrate the potential for secretins such as pIV to be used as adjuvants to increase the uptake and efficacy of antibiotics in bacteria. Finally, we compare the f1 pIV structure to its homologues to reveal similarities and differences between phage and bacterial secretins.

Abstract Phages are viruses that infect bacteria and dominate every ecosystem on our planet. As well as impacting microbial ecology, physiology and evolution, phages are exploited as tools in molecular biology and biotechnology. This is particularly true for the Ff (f1, fd or M13) phages, which represent a widely distributed group of filamentous viruses. Over nearly five decades, Ff has seen an extraordinary range of applications, including in phage display and nanotechnology. However, the complete structure of the phage capsid and consequently the mechanisms of infection and assembly remain largely mysterious. Using cryo-electron microscopy and a highly efficient system for production of short Ff-derived nanorods, we have determined the first structure of a filamentous virus, including the filament tips. Structure combined with mutagenesis was employed to identify domains of the phage that are important in bacterial attack and for release of new phage progeny. These data allow new models to be proposed for the phage lifecycle and will undoubtedly enable the development of novel biotechnological applications.