ABSTRACT The human genome contains numerous duplicated regions, such as parent-pseudogene pairs, causing sequencing reads to align equally well to either gene. The extent to which this ambiguity complicates transcriptomic analyses is currently unknown. This is concerning as many parent genes have been linked to disease, including GBA1, causally linked to both Parkinson’s and Gaucher disease. We find that most of the short sequencing reads that map to GBA1 , also map to its pseudogene, GBAP1 . Using long-read RNA-sequencing in human brain, where all reads mapped uniquely, we demonstrate significant differences in expression compared to short-read data. We identify novel transcripts from both GBA1 and GBAP1 , including protein-coding transcripts that are translated in vitro and detected in proteomic data, but that lack GCase activity. By combining long-read with single-nuclear RNA-sequencing to analyse brain-relevant cell types we demonstrate that transcript expression varies by brain region with cell-type-selectivity. Taken together, these results suggest a non-lysosomal function for both GBA1 and GBAP1 in brain. Finally, we demonstrate that inaccuracies in annotation are widespread among parent genes, with implications for many human diseases.

Mutations in GBA1 cause Gaucher disease and are the most important genetic risk factor for Parkinson’s disease. However, analysis of transcription at this locus is complicated by its highly homologous pseudogene, GBAP1 . We show that >50% of short RNA-sequencing reads mapping to GBA1 also map to GBAP1 . Thus, we used long-read RNA sequencing in the human brain, which allowed us to accurately quantify expression from both GBA1 and GBAP1 . We discovered significant differences in expression compared to short-read data and identify currently unannotated transcripts of both GBA1 and GBAP1 . These included protein-coding transcripts from both genes that were translated in human brain, but without the known lysosomal function—yet accounting for almost a third of transcription. Analyzing brain-specific cell types using long-read and single-nucleus RNA sequencing revealed region-specific variations in transcript expression. Overall, these findings suggest nonlysosomal roles for GBA1 and GBAP1 with implications for our understanding of the role of GBA1 in health and disease.

Abstract Background The identification of a heterozygous exonic GGC repeat expansion in ZFHX3 underlying spinocerebellar ataxia type 4 (SCA4) has solved a 25‐year diagnostic conundrum. We used adaptive long‐read sequencing to decipher the pathogenic expansion in the index Utah family and an unrelated family from Iowa of Swedish ancestry. Contemporaneous to our discovery, other groups identified the same repeat expansion in affected individuals from Utah, Sweden, and Germany, highlighting the current pivotal time for detection of novel repeat expansion disorders. Methods Given that the pathogenic repeat expansion is rare on a population level, we proposed a common ancestor across all families. Here, we employed targeted long‐read sequencing through adaptive sampling, enriching for the chr16q22 region of interest. Results Using phased sequencing results from individuals from Utah, Iowa, and Southern Sweden, we confirmed a common ~2000‐year‐old ancestral haplotype harbouring the repeat expansion. Conclusion This study provides further insight into the genetic architecture of SCA4. © 2024 The Author(s). Movement Disorders published by Wiley Periodicals LLC on behalf of International Parkinson and Movement Disorder Society.

Abstract Genome-wide association studies (GWAS) have identified a transcriptional network of Alzheimer’s disease (AD) risk genes that are primarily expressed in microglia and are associated with AD pathology. However, traditional short-read sequencers have limited our ability to fully characterize how GWAS variants exert their effects on gene expression regulation or alternative splicing in response to the pathology, particularly resulting in inaccurate detection of splicing. To address this gap, we utilized long-read RNA-sequencing (RNA-seq) in the App NL-G-F knock-in mouse model to identify changes in splicing and novel transcript isoforms in response to amyloid-β. We show that long-read RNA-seq can recapitulate the expected induction of microglial expressed risk genes such as Trem2 in response to amyloid-β at 9 months of age associated with ageing-dependent deficiencies in spatial short-term memory in the App NL-G-F knock-in mice. Our results not only identified novel splicing events and transcript isoform abundance in genes associated with AD, but also revealed the complex regulation of gene expression through splicing in response to amyloid plaques. Surprisingly, the regulation of alternative splicing in response to amyloid was seen in genes previously not identified as AD risk genes, expressed in microglia, neurons and oligodendrocytes, and included genes such as Syngr1 that modulate synaptic physiology. We saw alternative splicing in genes such as Ctsa , Clta , Dennd2a , Irf9 and Smad4 in mice in response to amyloid, and the orthologues of these genes also showed transcript usage changes in human AD brains. Our data suggests a model whereby induction of AD risk gene expression associated with microglial proliferation and activation is concomitant with alternative splicing in a different class of genes expressed by microglia and neurons, which act to adapt or preserve synaptic activity in response to amyloid-β during early stages of the disease. Our study provides new insights into the mechanisms and effects of the regulation of genes associated with amyloid pathology, which may ultimately enable better disease diagnosis, and improved tracking of disease progression. Additionally, our findings identify new therapeutic avenues for treatment of AD.

Summary The role of the SNCA gene locus in driving Parkinson’s disease (PD) through rare and common genetic variation is well-recognized, but the transcriptional diversity of SNCA in vulnerable cell types remains unclear. We performed SNCA long-read RNA sequencing in human dopaminergic neurons and show that annotated SNCA transcripts account for only 5% of expression. Rather, the majority of expression (75%) at the SNCA locus originates from transcripts with alternative 5’ and 3’ untranslated regions. Importantly, 10% originates from transcripts encoding open reading frames not previously annotated, which are translated and detectable in human postmortem brain. Defining the 3’ untranslated regions enabled the rational design of antisense oligonucleotides targeting the majority of SNCA transcripts, leading to the effective reversal of PD pathology, including protein aggregation, mitochondrial dysfunction, and toxicity. Resolving the complexity of the SNCA transcriptional landscape impacts RNA therapies and highlights differences in protein isoforms and their contribution to disease.