Abstract Germinal centers (GCs) are specialized compartments within the secondary lymphoid organs where B cells proliferate, differentiate, and mutate their antibody genes in response to the presence of foreign antigens. They play a central role in generating an effective immune response against infectious pathogens, and failures in their regulating mechanisms can lead to the development of autoimmune diseases and cancer. While previous works study experimental systems of the immune response with mouse models that are immunized with specific antigens, our study focuses on a real life situation, with an ongoing GC response in a human lymph node (LN) involving multiple asynchronized GCs reacting simultaneously to unknown antigens. We combined laser capture microdissection (LCM) of individual GCs from human LN with next-generation repertoire sequencing (Rep-seq) to characterize individual GCs as distinct evolutionary spaces. In line with well-characterized GC responses in mice, elicited by immunization with model antigens such as NP-CGG, we observe a relatively low sequence similarity, as well as heterogeneous clonal diversity across individual GCs from the same human LN. Still, we identify shared clones in several individual GCs, and phylogenetic tree analysis combined with paratope modeling suggest the re-engagement and rediversification of B-cell clones across GCs as well as expanded clones exhibiting shared antigen responses across distinct GCs, indicating convergent evolution of the GCs. Finally, our study allows for the characterization of non-functional clones, where frequencies of V(D)J or SHM induced stop codons are quantified.

Abstract The adaptive immune system has the extraordinary ability to produce a broad range of immunoglobulins that can bind a wide variety of antigens. During adaptive immune responses, activated B cells duplicate and undergo somatic hypermutation in their B-cell receptor (BCR) genes, resulting in clonal families of diversified B-cells that can be related back to a common ancestor. Advances in high-throughput sequencing technologies have enabled the high-throughput characterization of B-cell repertoires, however, the accurate identification of clonally related BCR sequences remains a major challenge. In this study, we compare three different clone identification methods on both simulated and experimental data, and investigate their impact on the characterization of B-cell diversity. We find that different methods may lead to different clonal definitions, which in turn can affect the quantification of clonal diversity in repertoire data. Interestingly, we find the Shannon entropy to be overall the most robust diversity index in regard to different clonal identification. Our analysis also suggests that the traditional germline gene alignment-based method for clonal identification remains the most accurate when the complete information about the sequence is known, but that alignment-free methods may be preferred for shorter read length. We make our implementation freely available as a Python library cdiversity .

RNA-sequencing and differential gene expression studies have significantly advanced our understanding of pathogenic pathways underlying Rheumatoid Arthritis (RA). Yet, little is known about cell-specific regulatory networks and their contributions to disease. In this study, we focused on fibroblast-like synoviocytes (FLS), a cell type central to disease pathogenesis and joint damage in RA. We used a strategy that computed sample-specific gene regulatory networks (GRNs) to compare network properties between RA and osteoarthritis FLS. We identified 28 transcription factors (TFs) as key regulators central to the signatures of RA FLS. Six of these TFs are new and have not been previously implicated in RA, and included BACH1, HLX, and TGIF1. Several of these TFs were found to be co-regulated, and BACH1 emerged as the most significant TF and regulator. The main BACH1 targets included those implicated in fatty acid metabolism and ferroptosis. The discovery of BACH1 was validated in experiments with RA FLS. Knockdown of BACH1 in RA FLS significantly affected the gene expression signatures, reduced cell adhesion and mobility, interfered with the formation of thick actin fibers, and prevented the polarized formation of lamellipodia, all required for the RA destructive behavior of FLS. This is the first time that BACH1 is shown to have a central role in the regulation of FLS phenotypes, and gene expression signatures, as well as in ferroptosis and fatty acid metabolism. These new discoveries have the potential to become new targets for treatments aimed at selectively targeting the RA FLS.

Rheumatoid arthritis (RA) is a common autoimmune and inflammatory disease characterized by inflammation and hyperplasia of the synovial tissues. RA pathogenesis involves multiple cell types, genes, transcription factors (TFs) and networks. Yet, little is known about the TFs, and key drivers and networks regulating cell function and disease at the synovial tissue level, which is the site of disease. In the present study, we used available RNA-seq databases generated from synovial tissues and developed a novel approach to elucidate cell type-specific regulatory networks on synovial tissue genes in RA. We leverage established computational methodologies to infer sample-specific gene regulatory networks and applied statistical methods to compare network properties across phenotypic groups (RA versus osteoarthritis). We developed computational approaches to rank TFs based on their contribution to the observed phenotypic differences between RA and controls across different cell types. We identified 18,16,19,11 key regulators of fibroblast-like synoviocyte (FLS), T cells, B cells, and monocyte signatures and networks, respectively, in RA synovial tissues. Interestingly, FLS and B cells were driven by multiple independent co-regulatory TF clusters that included MITF, HLX, BACH1 (FLS) and KLF13, FOSB, FOSL1 (synovial B cells). However, monocytes were collectively governed by a single cluster of TF drivers, responsible for the main phenotypic differences between RA and controls, which included RFX5, IRF9, CREB5. Among several cell subset and pathway changes, we also detected reduced presence of NKT cell and eosinophils in RA synovial tissues. Overall, our novel approach identified new and previously unsuspected KDG, TF and networks and should help better understanding individual cell regulation and co-regulatory networks in RA pathogenesis, as well as potentially generate new targets for treatment.

Deciphering the antigen recognition capabilities by T~cell and B~cell receptors (antibodies) is essential for advancing our understanding of adaptive immune system responses. In recent years, the development of protein language models (PLMs) has facilitated the development of bioinformatic pipelines where complex amino acid sequences are transformed into vectorized embeddings, which are then applied to a range of downstream analytical tasks. With their success, we have witnessed the emergence of domain-specific PLMs tailored to specific proteins, such as immune receptors. Domain-specific models are often assumed to possess enhanced representation capabilities for targeted applications, however, this assumption has not been thoroughly evaluated. In this manuscript, we assess the efficacy of both generalist and domain-specific transformer-based embeddings in characterizing B and T cell receptors. Specifically, we assess the accuracy of models that leverage these embeddings to predict antigen specificity and elucidate the evolutionary changes that B cells undergo during an immune response. We demonstrate that the prevailing notion of domain-specific models outperforming general models requires a more nuanced examination. We also observe remarkable differences between generalist and domain-specific PLMs, not only in terms of performance but also in the manner they encode information. Finally, we observe that the choice of the size and the embedding layer in PLMs are essential model hyperparameters in different tasks. Overall, our analyzes reveal the promising potential of PLMs in modeling protein function while providing insights into their information handling capabilities. We also discuss the crucial factors that should be taken into account when selecting a PLM tailored to a particular task.