Abstract Background Whole-genome sequencing (WGS) is becoming an increasingly popular tool to study the population genetics and drug resistance of Plasmodium spp. However, the predominance of human DNA in a malaria patient blood sample requires time-consuming lab procedures to filter out human DNA or enrich Plasmodium DNA. Here, we investigated the potential of adaptive sampling to enrich for Plasmodium DNA while sequencing unenriched patient blood samples on a minION device. Results To compare adaptive sampling versus regular sequencing, a dilution series consisting of 0% up to 100% P. falciparum DNA in human DNA was sequenced. Half of the flowcell channels were run in adaptive sampling mode, enriching for the P. falciparum reference genome, resulting in a 3.2 fold enrichment of P. falciparum bases on average. Samples with a lower concentration of parasite DNA had a higher enrichment potential. We confirmed these findings by sequencing two P. falciparum patient blood samples with common levels of parasitaemia (0.1% and 0.2%). The estimated enrichment was 3.9 and 5.8, which was sufficient to cover at least 97% of the P. falciparum reference genome at a median depth of 20 (highest parasitaemia) or 5 (lowest parasitaemia). A comparison of 38 drug resistance variants (WHO) obtained via adaptive sequencing or Sanger sequencing showed a high concordance between the two methods, suggesting that the obtained sequencing data is of sufficient quality to address common clinical research questions for patients with parasitaemias of 0.1% and higher. Conclusions Our results demonstrate that adaptive Nanopore sequencing has the potential to replace more time-consuming Plasmodium -enrichment protocols and sequence directly from patient blood, given further improvements in cost-efficiency.

Abstract Aneuploidy causes system-wide disruptions in the stochiometric balances of transcripts, proteins, and metabolites, often resulting in detrimental effects for the organism. The protozoan parasite Leishmania has an unusually high tolerance for aneuploidy, but the molecular and functional consequences for the pathogen remain poorly understood. Here, we addressed this question in vitro and present the first integrated analysis of the genome, transcriptome, proteome, and metabolome of highly aneuploid Leishmania donovani strains. Our analyses unambiguously establish that aneuploidy in Leishmania proportionally impacts the average transcript- and protein abundance levels of affected chromosomes, ultimately correlating with the degree of metabolic differences between strains. This proportionality was present in both proliferative and non-proliferative in vitro promastigotes. However, protein complex subunits and non-cytoplasmic proteins, showed dosage compensation, responding less or even not at all to aneuploidy-induced dosage changes. In contrast to other Eukaryotes, we did not observe the widespread regulation at the transcript level that typically modulates some of the negative effects of aneuploidy. Further, the majority of differentially expressed proteins between aneuploid strains were encoded by non-aneuploid chromosomes and were not driven by a significant underlying transcript change, suggesting that aneuploidy is accompanied by extensive post-transcriptional protein-level modulation. This makes Leishmania a unique Eukaryotic model for elucidating post-transcriptional protein-abundance modulation in the context of aneuploidy.

Abstract Accurate molecular detection of resistance to bedaquiline, a core drug for the treatment of drug resistant tuberculosis, remains challenging. In this study, we investigated whether three sequence- and nine structure-based features describing the impact of Rv0678 variants on the MmpR transcriptional repressor could predict the bedaquiline phenotype of isolates containing Rv0678 variants. Paired genotypic and phenotypic data was used to train a binary random forest classifier. The mean value of the individual features was similar for resistant and susceptible variants (p≥0.05). Leave one out cross validation showed predictability of bedaquiline resistance from Rv0678 variants when using a binary classifier with a combination of sequence and structural features (ROC AUC = 0.766; f1 score = 0.746), but the performance was too low for clinically use. Evolutionary conservation of the affected residue was the most important individual feature (mean decrease in impurity = 0.226 ± 0.003) to discriminate bedaquiline resistance from susceptibility. Prediction of bedaquiline resistance was only possible when restricting the data to missense variants, as the selected features could not be applied to Rv0678 insertions and deletions. Additionally, prediction of bedaquiline resistance was only possible when restricting the data to isolates for which the phenotype was determined using Mycobacterial Growth Indicator Tubes, suggesting possible misclassification of the bedaquiline phenotype by other methods. The results of this study suggest that structural features describing Rv0678 missense variants could be used to predict bedaquiline resistance, albeit not yet at the performance level required for clinical practice. Author summary Guidelines by the World Health Organization indicate that antibiotic resistant tuberculosis should be treated with bedaquiline, a newly discovered antibiotic. However, resistance to bedaquiline has already emerged and is spreading rapidly. More than 500 different variants have been discovered in the bedaquiline resistance genes in Mycobacterium tuberculosis. It is not known which DNA variants specifically drive bedaquiline resistance due to insufficiency of data. Here, we used a machine learning technique to predict whether a variant in the Rv0678 gene confers bedaquiline resistance. To this end, for each variant we defined features that describe the impact of the variant on the MmpR (encoded by the Rv0678 gene) protein structure. These features were then fed into a classification algorithm to predict bedaquiline resistance. We successfully developed a bedaquiline resistance prediction model, although performance was limited. We also found that accurate predictions were only possible when restricting the data to samples that were tested on the MGIT platform, a World Health Organization endorsed method to test for bedaquiline resistance. Our study shows that predicting bedaquiline resistance from protein structural features is feasible. Furthermore, our study provides new insights into phenotypic testing platforms to assess bedaquiline resistance.

Abstract In high-throughput omics disciplines like transcriptomics, researchers face a need to assess the quality of an experiment prior to an in-depth statistical analysis. To efficiently analyze such voluminous collections of data, researchers need triage methods that are both quick and easy to use. Such a normalization method for relative quantitation, CONSTANd, was recently introduced for isobarically-labeled mass spectra in proteomics. It transforms the data matrix of abundances through an iterative, convergent process enforcing three constraints: (I) identical column sums; (II) each row sum is fixed (across matrices) and (III) identical to all other row sums. In this study, we investigate whether CONSTANd is suitable for count data from massively parallel sequencing, by qualitatively comparing its results to those of DESeq2. Further, we propose an adjustment of the method so that it may be applied to identically balanced but differently sized experiments for joint analysis. We find that CONSTANd can process large data sets with about 2 million count records in less than a second whilst removing unwanted systematic bias and thus quickly uncovering the underlying biological structure when combined with a PCA plot or hierarchical clustering. Moreover, it allows joint analysis of data sets obtained from different batches, with different protocols and from different labs but without exploiting information from the experimental setup other than the delineation of samples into identically processed sets (IPSs). CONSTANd’s simplicity and applicability to proteomics as well as transcriptomics data make it an interesting candidate for integration in multi-omics workflows.

Abstract The implementation of prospective drug resistance (DR) studies in the R&D pipelines is a common practice for many infectious diseases, but not for Neglected Tropical Diseases. Here, we explored and demonstrated the importance of this approach, using as paradigms Leishmania donovani , the etiological agent of Visceral Leishmaniasis (VL), and TCMDC-143345, a promising compound of the GSK ‘Leishbox’ to treat VL. We experimentally selected resistance to TCMDC-143345 in vitro and characterized resistant parasites at genomic and phenotypic levels. We found that it took more time to develop resistance to TCMDC-143345 than to other drugs in clinical use and that there was no cross resistance to these drugs, suggesting a new and unique mechanism. By whole genome sequencing, we found two mutations in the gene encoding the L. donovani dynamin-1-like protein (LdoDLP1) that were fixed at highest drug pressure. Through phylogenetic analysis, we identified LdoDLP1 as a family member of the dynamin-related proteins, a group of proteins that impacts the shapes of biological membranes by mediating fusion and fission events, with a putative role in mitochondrial fission. We found that L. donovani lines genetically engineered to harbor the two identified LdoDLP1 mutations were resistant to TCMDC-143345 and displayed altered mitochondrial properties. By homology modeling, we showed how the two LdoDLP1 mutations may influence protein structure and function. Taken together, our data reveal a clear involvement of LdoDLP1 in the adaptation/resistance of L. donovani to TCMDC-143345. Importance Humans and their pathogens are continuously locked in a molecular arms race during which the eventual emergence of pathogen drug resistance (DR) seems inevitable. For neglected tropical diseases (NTDs), DR is generally studied retrospectively, once it has already been established in clinical settings. We previously recommended to keep one step ahead in the host-pathogen arms race and implement prospective DR studies in the R&D pipeline, a common practice for many infectious diseases, but not for NTDs. Here, using Leishmania donovani , the etiological agent of Visceral Leishmaniasis (VL), and TCMDC-143345, a promising compound of the GSK ‘Leishbox’ to treat VL, as paradigms, we experimentally selected resistance to the compound and proceeded to genomic and phenotypic characterization of DR parasites. The results gathered in the present study suggest a new DR mechanism involving the L. donovani dynamin-1 like protein (LdoDLP1) and demonstrate the practical relevance of prospective DR studies.

Cytosine C5 methylation is an important epigenetic control mechanism in a wide array of Eukaryotic organisms and generally carried out by proteins of C-5 DNA methyltransferase family (DNMTs). In several protozoans the status of this mechanism remains elusive, such as in Leishmania , the causative agent of the disease leishmaniasis in humans and a wide array of vertebrate animals. In this work, we show that the Leishmania donovani genome contains a C-5 DNA methyltransferase ( DNMT ) from the DNMT6 subfamily, of which the function is still unclear, and verified its expression at RNA level. We created viable overexpressor and knock-out lines of this enzyme and characterised their genome-wide methylation patterns using whole-genome bisulfite sequencing, together with promastigote and amastigote control lines. Interestingly, despite DNMT6 presence, we found that methylation levels were equal to or lower than 0.0003% at CpG sites, 0.0005% at CHG sites and 0.0126% at CHH sites at genome scale. As none of the methylated sites were retained after manual verification, we conclude that there is no evidence for DNA methylation in this species. A similar absence of DNA methylation was observed for the blood form of Trypanosoma brucei , another Trypanosomatid species. We demonstrate that this difference in DNA methylation between the parasite (no detectable DNA methylation) and the vertebrate host (DNA methylation), allows enrichment of parasite DNA using Methyl-CpG-binding domain columns, readily available in commercial kits. As such, we depleted methylated DNA from 1) mixes of Leishmania promastigote and amastigote DNA with human DNA and 2) THP-1 cells infected with Leishmania amastigotes. This resulted in 62x to 263x Leishmania :human enrichment, depending on the dilution and type of sample studied. These results open a promising avenue for including an unmethylated DNA enrichment step as a pre-enrichment before sequencing clinical samples.

Ferroptosis is a lipid peroxidation-dependent mechanism of regulated cell death known to suppress tumor proliferation and progression. Although several genetic and protein hallmarks have been identified in ferroptotic cell death, it remains challenging to fully characterize ferroptosis signaling pathways and to find suitable biomarkers. Moreover, changes taking place in the epigenome of ferroptotic cells remain poorly studied. In this context, we aimed to investigate the role of chromatin remodeler forkhead box protein A1 (FOXA1) in RSL3-treated multiple myeloma cells because, similar to ferroptosis, this transcription factor has been associated with changes in the lipid metabolism, DNA damage, and epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). RNA sequencing and Western blot analysis revealed that FOXA1 expression is consistently upregulated upon ferroptosis induction in different in vitro and in vivo disease models. In silico motif analysis and transcription factor enrichment analysis further suggested that ferroptosis-mediated FOXA1 expression is orchestrated by specificity protein 1 (Sp1), a transcription factor known to be influenced by lipid peroxidation. Remarkably, FOXA1 upregulation in ferroptotic myeloma cells did not alter hormone signaling or EMT, two key downstream signaling pathways of FOXA1. CUT&RUN genome-wide transcriptional binding site profiling showed that GPX4-inhibition by RSL3 triggered loss of binding of FOXA1 to pericentromeric regions in multiple myeloma cells, suggesting that this transcription factor is possibly involved in genomic instability, DNA damage, or cellular senescence under ferroptotic conditions. Abstract Figure

Current T-cell epitope prediction tools are a valuable resource in designing targeted immunogenicity experiments. They typically focus on, and are able to, accurately predict peptide binding and presentation by major histocompatibility complex (MHC) molecules on the surface of antigen-presenting cells. However, recognition of the peptide-MHC complex by a T-cell receptor is often not included in these tools. We developed a classification approach based on random forest classifiers to predict recognition of a peptide by a T-cell and discover patterns that contribute to recognition. We considered two approaches to solve this problem: (1) distinguishing between two sets of T-cell receptors that each bind to a known peptide and (2) retrieving T-cell receptors that bind to a given peptide from a large pool of T-cell receptors. Evaluation of the models on two HIV-1, B*08-restricted epitopes reveals good performance and hints towards structural CDR3 features that can determine peptide immunogenicity. These results are of particularly importance as they show that prediction of T-cell epitope and T-cell epitope recognition based on sequence data is a feasible approach. In addition, the validity of our models not only serves as a proof of concept for the prediction of immunogenic T-cell epitopes but also paves the way for more general and high performing models.

Abstract Background Plasmodium vivax is the second most important cause of human malaria worldwide, and accounts for the majority of malaria cases in South America. A high-quality reference genome exists for Papua Indonesia (PvP01) and Thailand (PvW1), but is lacking for South America. A reference genome specifically for South America would be beneficial though, as P. vivax is a genetically diverse parasite with geographical clustering. Results This study presents a new high-quality assembly of a South American P. vivax isolate, referred to as PvPAM. The genome was obtained from a low input patient sample from the Peruvian Amazon and sequenced using PacBio technology, resulting in a highly complete assembly with 6497 functional genes. Telomeric ends were present in 17 out of 28 chromosomal ends, and additional (sub)telomeric regions are present in 12 unassigned contigs. A comparison of multigene families between PvPAM and the PvP01 genome revealed remarkable variation in vir genes, and the presence of merozoite surface proteins (MSP) 3.6 and 3.7. Three dhfr and dhps drug resistance associated mutations are present in PvPAM, similar to those found in other Peruvian isolates. Mapping of publicly available South American whole genome sequencing (WGS) data to PvPAM resulted in significantly fewer variants and truncated reads compared to the use of PvP01 or PvW1 as reference genomes. To minimize the number of core genome variants in non-South American samples, PvW1 is most suited for Southeast Asian isolates, both PvPAM and PvW1 are suited for South Asian isolates, and PvPAM is recommended for African isolates. Interestingly, non-South American samples still contained the least subtelomeric variants when mapped to PvPAM, indicating high quality of the PvPAM subtelomeric regions. Conclusions Our findings show that the PvPAM reference genome more accurately represents South American P. vivax isolates in comparison to PvP01 and PvW1. In addition, PvPAM has a high level of completeness, and contains a similar number of annotated genes as PvP01 or PvW1. The PvPAM genome therefore will be a valuable resource to improve future genomic analyses on P. vivax isolates from the South American continent.