Abstract The endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) is a highly conserved protein machinery that drives a divers set of physiological and pathological membrane remodeling processes. However, the structural basis of ESCRT-III polymers stabilizing, constricting and cleaving negatively curved membranes is yet unknown. Here we present cryo electron microscopy structures of membrane-coated CHMP2A-CHMP3 filaments of two different diameters at 3.3 and 3.6 Å resolution. The structures reveal helical filaments assembled by CHMP2A-CHMP3 heterodimers in the open ESCRT-III conformation, which generates a partially positive charged membrane interaction surface, positions short N-terminal motifs for membrane interaction and the C-terminal VPS4 target sequence towards the tube interior. Inter-filament interactions are electrostatic, which facilitate filament sliding upon VPS4-mediated polymer remodeling. Fluorescence microscopy as well as high speed atomic force microscopy imaging corroborate that CHMP2A-CHMP3 polymers and VPS4 can constrict and cleave narrow membrane tubes, thus acting as a minimal membrane fission machinery.

Abstract Single-molecule force spectroscopy (SMFS) uses the cantilever tip of an AFM to apply a force able to unfold a single protein. The obtained force-distance curve encodes the unfolding pathway, and from its analysis it is possible to characterize the folded domains. SMFS has been mostly used to study the unfolding of purified proteins, in solution or reconstituted in a lipid bilayer. Here, we describe a pipeline for analyzing membrane proteins based on SMFS, that involves the isolation of the plasma membrane of single cells and the harvesting of force-distance curves directly from it. We characterized and identified the embedded membrane proteins combining, within a Bayesian framework, the information of the shape of the obtained curves, with the information from Mass Spectrometry and proteomic databases. The pipeline was tested with purified/reconstituted proteins and applied to five cell types where we classified the unfolding of their most abundant membrane proteins. We validated our pipeline by overexpressing 4 constructs, and this allowed us to gather structural insights of the identified proteins, revealing variable elements in the loop regions. Our results set the basis for the investigation of the unfolding of membrane proteins in situ, and for performing proteomics from a membrane fragment.

ESCRT-III proteins are involved in many membrane remodeling processes including multivesicular body biogenesis as first discovered in yeast. In humans, CHMP2 exists as two potential isoforms, CHMP2A and CHMP2B, but their physical characteristics have not been compared yet. Here, we use a combination of technics on biomimetic systems and purified proteins to study their affinity and effects on membranes. We establish that CHMP2B binding is enhanced in the presence of PI(4,5)P2 lipids. In contrast, CHMP2A does not display lipid specificity and requires CHMP3 for binding significantly to membranes. On the micrometer scale and at moderate bulk concentrations, CHMP2B forms a reticular structure on membranes whereas CHMP2A (+CHMP3) binds homogeneously. Eventually, CHMP2A and CHMP2B unexpectedly induce different mechanical effects to membranes: CHMP2B strongly rigidifies them while CHMP2A (+CHMP3) has no significant effect. Altogether, we conclude that CHMP2B and CHMP2A cannot be considered as isoforms and might thus contribute differently to membrane remodeling processes.

Endosomal sorting complexes required for transport-III (ESCRT-III) are thought to assemble in vivo inside membrane structures with a negative Gaussian curvature. How membrane shape influences ESCRT-III polymerization and conversely how ESCRT-III polymers shape membranes is still unclear. Here, we used human core ESCRT-III proteins, CHMP4B, CHMP2A, CHMP2B and CHMP3 to address this issue in vitro by combining membrane nanotube pulling experiments, cryo-electron microscopy, cryo-electron tomography and high-speed AFM. We show that CHMP4B filaments bind preferentially to flat membranes or to membrane tubes with a positive mean curvature. Both CHMP2B and CHMP2A/CHMP3 assemble on positively curved membrane tubes, the latter winding around the tubes. Although combinations of CHMP4B/CHMP2B and CHMP4B/CHMP2A/CHMP3 are recruited to the neck of pulled membrane tubes, they also reshape large unilamellar vesicles into helical membrane tubes with a pipe surface shape. Sub-tomogram averaging reveals that the filaments assemble parallel to the tube axis with some local perpendicular connections, highlighting the particular mechanical stresses imposed by ESCRT-III to stabilize the corkscrew-like membrane architecture. Our results thus underline the versatile membrane remodeling activity of ESCRT-III that may be a general feature of ESCRT-III required for all or selected cellular membrane remodeling processes.

Antimicrobial resistance is a leading mortality factor worldwide. Here we report the discovery of clovibactin, a new antibiotic, isolated from uncultured soil bacteria. Clovibactin efficiently kills drug-resistant bacterial pathogens without detectable resistance. Using biochemical assays, solid-state NMR, and atomic force microscopy, we dissect its mode of action. Clovibactin blocks cell wall synthesis by targeting pyrophosphate of multiple essential peptidoglycan precursors (C 55 PP, Lipid II, Lipid WTA ). Clovibactin uses an unusual hydrophobic interface to tightly wrap around pyrophosphate, but bypasses the variable structural elements of precursors, accounting for the lack of resistance. Selective and efficient target binding is achieved by the irreversible sequestration of precursors into supramolecular fibrils that only form on bacterial membranes that contain lipid-anchored pyrophosphate groups. Uncultured bacteria offer a rich reservoir of antibiotics with new mechanisms of action that could replenish the antimicrobial discovery pipeline.

Abstract Long double-stranded (ds) RNA in the cytosol acts as a potent inflammatory molecule recognized by the receptor MDA5, triggering the innate immune response. Mutations in MDA5 affecting dsRNA recognition can lead to increased infection sensitivity or autoimmune disease. The current model proposes that MDA5 nucleoprotein filament assembly-disassembly dynamics regulates long dsRNA recognition and signaling. We show that MDA5 preferentially loads onto dsRNA via a 3’ recessed end and uses ATP hydrolysis to translocate towards the 5’-end until obstructed, such as by another MDA5 on the opposite strand. Multiple MDA5 monomers accumulate at the blockade, forming a partial filament that extrudes the associated RNA in single-stranded loops and thereby compacting the MDA5-RNA complex. The compacted state is further stabilized by oligomerization of the MDA5’s caspase recruitment domain (CARD) and can withstand significant forces, offering an alternative intermediate in the activation of MDA5-dependent innate immunity.

Abstract Antimicrobial resistance is one of the leading concerns in medical care. Here we resolve the functional mechanism of the antimicrobial action of the cationic tripeptide AMC-109 by combining high speed-atomic force microscopy, molecular dynamics, fluorescence assays, and lipidomic analysis. We show that AMC-109 activity on the negatively charged plasma membrane of Staphylococcus aureus consists of two crucial steps. First, AMC-109 self-assembles into stable aggregates with specificity for negatively charged membranes. Second, by incorporation into the S. aureus membrane the lateral membrane organization is affected, dissolving membrane nanodomains. Domain dissolution affects membrane functions such as protein sorting and cell wall synthesis, and is suggested to cause a loss of resistance of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) to methicillin. As the AMC-109 mode of action is similar to the activity of the disinfectant benzalkonium chloride (BAK), a broad applicability, but with low cytotoxicity to human cells, is expected.