To prospectively evaluate the diagnostic and clinical utility of singleton whole-exome sequencing (WES) as a first-tier test in infants with suspected monogenic disease.Singleton WES was performed as a first-tier sequencing test in infants recruited from a single pediatric tertiary center. This occurred in parallel with standard investigations, including single- or multigene panel sequencing when clinically indicated. The diagnosis rate, clinical utility, and impact on management of singleton WES were evaluated.Of 80 enrolled infants, 46 received a molecular genetic diagnosis through singleton WES (57.5%) compared with 11 (13.75%) who underwent standard investigations in the same patient group. Clinical management changed following exome diagnosis in 15 of 46 diagnosed participants (32.6%). Twelve relatives received a genetic diagnosis following cascade testing, and 28 couples were identified as being at high risk of recurrence in future pregnancies.This prospective study provides strong evidence for increased diagnostic and clinical utility of singleton WES as a first-tier sequencing test for infants with a suspected monogenic disorder. Singleton WES outperformed standard care in terms of diagnosis rate and the benefits of a diagnosis, namely, impact on management of the child and clarification of reproductive risks for the extended family in a timely manner.Genet Med 18 11, 1090-1096.

Abstract Short tandem repeat (STR) expansions have been identified as the causal DNA mutation in dozens of Mendelian diseases. Historically, pathogenic STR expansions could only be detected by single locus techniques, such as PCR and electrophoresis. The ability to use short read sequencing data to screen for STR expansions has the potential to reduce both the time and cost to reaching diagnosis and enable the discovery of new causal STR loci. Most existing tools detect STR variation within the read length, and so are unable to detect the majority of pathogenic expansions. Those tools that can detect large expansions are limited to a set of known disease loci and as yet no new disease causing STR expansions have been identified with high-throughput sequencing technologies. Here we address this by presenting STRetch, a new genome-wide method to detect STR expansions at all loci across the human genome. We demonstrate the use of STRetch for detecting pathogenic STR expansions in short-read whole genome sequencing data with a very low false discovery rate. We further demonstrate the application of STRetch to solve cases of patients with undiagnosed disease and apply STRetch to the analysis of 97 whole genomes to reveal variation at STR loci. STRetch assesses expansions at all STR loci in the genome and allows screening for novel disease-causing STRs. STRetch is open source software, available from github.com/Oshlack/STRetch .

Detection of copy number variation (CNVs) is a challenging but highly valuable application of exome and targeted high throughput sequencing (HTS) data. While there are dozens of CNV detection methods available, using these methods remains challenging due to variable accuracy both across different data sets and within the same data set with different methods. We propose that extracting good results from CNV detection on HTS data requires a systematic approach involving rigorous quality control, adjustment of method parameters and calibration of confidence measures for filtering results. We present Ximmer, a tool which supports an end to end process for applying these procedures including a simulation framework, CNV detection analysis pipeline, and a visualisation and curation tool which enables interactive exploration of CNV results. We apply Ximmer to perform a comprehensive evaluation of CNV detection on four data sets using four different detection methods, representing one of the most comprehensive evaluations to date. Ximmer is open source and freely available at http://ximmer.org (example results are viewable at http://example.ximmer.org).

As costs of high throughput sequencing have fallen, we are seeing vast quantities of short read genomic data being generated. Often, the data is exchanged and stored as aligned reads, which provides high compression and convenient access for many analyses. However, aligned data becomes outdated as new reference genomes and alignment methods become available. Moreover, some applications cannot utilise pre-aligned reads at all, necessitating conversion back to raw format (FASTQ) before they can be used. In both cases, the process of extraction and realignment is expensive and time consuming. We describe Bazam, a tool that efficiently extracts the original paired FASTQ from reads stored in aligned form (BAM or CRAM format). Bazam extracts reads in a format that directly allows realignment with popular aligners with high concurrency. Through eliminating steps and increasing the accessible concurrency, Bazam facilitates up to a 90% reduction in the time required for realignment compared to standard methods. Bazam can support selective extraction of read pairs from focused genomic regions, further increasing efficiency for targeted analyses. Bazam is additionally suitable as a base for other applications that require efficient paired read information, such as quality control, structural variant calling and alignment comparison.

The benefits of implementing high throughput sequencing in the clinic are quickly becoming apparent. However, few freely available bioinformatics pipelines have been built from the ground up with clinical genomics in mind. Here we present Cpipe, a pipeline designed specifically for clinical genetic disease diagnostics. Cpipe was developed by the Melbourne Genomics Health Alliance, an Australian initiative to promote common approaches to genomics across healthcare institutions. As such, Cpipe has been designed to provide fast, effective and reproducible analysis, while also being highly flexible and customisable to meet the individual needs of diverse clinical settings. Cpipe is being shared with the clinical sequencing community as an open source project and is available at http://cpipeline.org.

Pharmacogenomics (PGx) investigates the influence of genetics on drug responses, enabling tailored treatments for personalized healthcare. This study assessed the accuracy of genotyping six genes using whole genome sequencing with four different computational tools and various sequencing depths. The effects of using different reference genomes (GRCh38 and GRCh37) and sequence aligners (BWA-MEM and Bowtie2) were also explored. The results showed generally minor variations in tool performance across most genes; however, more notable discrepancies were observed in the analysis of the complex CYP2D6 gene. Cyrius, a CYP2D6-specific tool, demonstrated the most robust performance, achieving the highest concordance rates for CYP2D6 in all instances, comparable to the consensus approach in most cases. There were rather small differences between the samples with 20× coverage depth and those with higher depth, but the decreased performance was more evident at lower depths, particularly at 5×. Additionally, variations in CYP2D6 results were observed when samples were aligned to different reference genomes using the same method, or to the same genome using different aligners, which led to reporting incorrect rare star alleles in several cases. These findings inform the selection of optimal PGx tools and methodologies as well as suggest that employing a consensus approach with two or more tools might be preferable for certain genes and tool combinations, especially at lower sequencing depths, to ensure accurate results. Additionally, we show how the upstream alignment can affect the performance of tools, an important factor to take into account.