ABSTRACT Campylobacter jejuni is the leading cause of bacterial food-borne infection; chicken meat is its main source. C. jejuni is considered commensal in chickens based on experimental models unrepresentative of commercial production. Here we show that the paradigm of Campylobacter commensalism in the chicken is flawed. Through experimental infection of four commercial breeds of broiler chickens, we show that breed has a significant effect on C. jejuni infection and the immune response of the animals, although these factors have limited impact on the number of bacteria in chicken ceca. All breeds mounted an innate immune response. In some breeds, this response declined when interleukin-10 was expressed, consistent with regulation of the intestinal inflammatory response, and these birds remained healthy. In another breed, there was a prolonged inflammatory response, evidence of damage to gut mucosa, and diarrhea. We show that bird type has a major impact on infection biology of C. jejuni . In some breeds, infection leads to disease, and the bacterium cannot be considered a harmless commensal. These findings have implications for the welfare of chickens in commercial production where C. jejuni infection is a persistent problem. IMPORTANCE Campylobacter jejuni is the most common cause of food-borne bacterial diarrheal disease in the developed world. Chicken is the most common source of infection. C. jejuni infection of chickens had previously not been considered to cause disease, and it was thought that C. jejuni was part of the normal microbiota of birds. In this work, we show that modern rapidly growing chicken breeds used in intensive production systems have a strong inflammatory response to C. jejuni infection that can lead to diarrhea, which, in turn, leads to damage to the feet and legs on the birds due to standing on wet litter. The response and level of disease varied between breeds and is related to regulation of the inflammatory immune response. These findings challenge the paradigm that C. jejuni is a harmless commensal of chickens and that C. jejuni infection may have substantial impact on animal health and welfare in intensive poultry production .

Significance Common features have been observed in the genome sequences of bacterial pathogens that infect few hosts. These “host adaptations” include the acquisition of pathogenicity islands of multiple genes involved in disease, losses of whole genes, and even single mutations that affect gene function. Within Salmonella enterica is a natural model system of four pathogens that are each other’s closest relatives, including a host-generalist, two host-specialists, and one with strong host associations. With whole-genome sequences, we aimed to improve our understanding of the number, nature, and order of these host adaptation events, shedding light on how human and animal pathogens arose in the past, and potentially allowing us to predict how emerging pathogens will evolve in the future.

Abstract Background The natural environment serves as a potential reservoir for Campylobacter, the leading cause of bacterial gastroenteritis in humans. However, little is understood about the mechanisms underlying variations in survival characteristics between different strains of C. jejuni in natural environments, including water. Results We identified three Campylobacter jejuni strains that exhibited variability in their ability to retain culturability after suspension in water at two different temperatures (4°C and 25°C). Of the three, strains C. jejuni M1 exhibited the most rapid loss of culturability whilst retaining viability. Using RNAseq transcriptomics, we characterised C. jejuni M1 gene expression in response to suspension in water by analyzing bacterial suspensions recovered immediately after introduction into water (Time 0), and from two sampling time/temperature combinations where considerable loss of culturability was evident, namely (i) after 24 h at 25°C, and (ii) after 72 h at 4°C. Transcript data were compared with a culture-grown control. Some gene expression characteristics were shared amongst the three populations recovered from water, with more genes being up-regulated than down. Many of the up-regulated genes were identified in the Time 0 sample, whereas the majority of down-regulated genes occurred in the 25°C (24 h) sample. Conclusions Variations in expression were found amongst genes associated with oxygen tolerance, starvation and osmotic stress. However, we also found upregulation of flagellar assembly genes, accompanied by down-regulation of genes involved in chemotaxis. Our data also suggested a switch from secretion via the sec system to via the tat system, and that the quorum sensing gene luxS may be implicated in the survival of strain M1 in water. Variations in gene expression also occurred in accessory genome regions. Our data suggest that despite the loss of culturability, C. jejuni M1 remains viable and adapts via specific changes in gene expression.

Abstract Infection by Campylobacter is recognised as the most common cause of foodborne bacterial illness worldwide. Faecal contamination of meat, especially chicken, during processing represents a key route of transmission to humans. There is currently no licenced vaccine and no Campylobacter -resistant chickens. In addition, preventative measures aimed at reducing environmental contamination and exposure of chickens to Campylobacter jejuni (biosecurity) have been ineffective. There is much interest in the factors/mechanisms that drive C. jejuni colonisation and infection of animals, and survival in the environment. It is anticipated that understanding these mechanisms will guide the development of effective intervention strategies to reduce the burden of C. jejuni infection. Here we present a comprehensive analysis of C. jejuni fitness during growth and survival within and outside hosts. A comparative analysis of transposon (Tn) gene inactivation libraries in three C. jejuni strains by Tn-seq demonstrated that a large proportion, 331 genes, of the C. jejuni genome is dedicated to ( in vitro ) growth. An extensive Tn library in C. jejuni M1cam (~10,000 mutants) was screened for the colonisation of commercial broiler chickens, survival in houseflies and under nutrient-rich and–poor conditions at low temperature, and infection of human gut epithelial cells. We report C. jejuni factors essential throughout its life cycle and we have identified genes that fulfil important roles across multiple conditions, including maf3, fliW, fliD, pflB and capM , as well as novel genes uniquely implicated in survival outside hosts. Taking a comprehensive screening approach has confirmed previous studies, that the flagella are central to the ability of C. jejuni to interact with its hosts. Future efforts should focus on how to exploit this knowledge to effectively control infections caused by C. jejuni . Author Summary Campylobacter jejuni is the leading bacterial cause of human diarrhoeal disease. C. jejuni encounters and has to overcome a wide range of “stress” conditions whilst passing through the gastrointestinal tract of humans and other animals, during processing of food products, on/in food and in the environment. We have taken a comprehensive approach to understand the basis of C. jejuni growth and within/outside host survival, with the aim to inform future development of intervention strategies. Using a genome-wide transposon gene inactivation approach we identified genes core to the growth of C. jejuni . We also determined genes that were required during the colonisation of chickens, survival in the housefly and under nutrient-rich and –poor conditions at low temperature, and during interaction with human gut epithelial tissue culture cells. This study provides a comprehensive dataset linking C. jejuni genes to growth and survival in models relevant to its life cycle. Genes important across multiple models were identified as well as genes only required under specific conditions. We identified that a large proportion of the C. jejuni genome is dedicated to growth and that the flagella fulfil a prominent role in the interaction with hosts. Our data will aid development of effective control strategies.

Abstract Background Exposure to microbes early in life has long-lasting effects on microbial community structure and function of the microbiome. However, in commercial poultry settings chicks are reared as a single-age cohort with no exposure to adult birds which can have profound effects on microbiota development and subsequent pathogen challenge. Microbiota manipulation is a proven and promising strategy to help reduce pathogen load and transmission within broiler flocks. Results Manipulation of the microbiota between 4 and 72 hours of hatch markedly reduces faecal shedding and colonisation with the foodborne pathogen Salmonella enterica serovar Typhimurium (ST4/74). Administration route has minimal effect on the protection conferred with fewer birds in transplant groups shown to shed ST4/74 in the faeces compared to PBS-gavaged control birds. Analysis of the microbiome following transplantation demonstrated that the relative abundance of the anti-inflammatory bacterium Faecalibacterium prausnitzii was significantly higher in CMT groups compared to PBS controls. The presence of F. prausnitzii was also shown to increase in PBS-challenged birds compared to unchallenged birds potentially indicating a role of this bacterium in limiting Salmonella infections. Conclusions This study highlights the efficacy of using microbiome transplants as a means to reduce colonisation and shedding of Salmonella in chickens. Effective protection can be conferred during the first few days of a chick’s life regardless of time point and traditional hatchery delivery systems are sufficient to alter the microbiome and transfer donor material. Early microbiota intervention in chickens is a promising route of pathogen control in broiler flocks in the fight to control food-borne outbreaks in the human population.

Salmonella enterica serovar Typhimurium ST313 is a relatively newly emerged sequence type that is causing a devastating epidemic of bloodstream infections across sub-Saharan Africa. Analysis of hundreds of Salmonella genomes has revealed that ST313 is closely-related to the ST19 group of S. Typhimurium that cause gastroenteritis across the world. The core genomes of ST313 and ST19 vary by just 1000 single-nucleotide polymorphisms (SNPs). We hypothesised that the phenotypic differences that distinguish African Salmonella from ST19 are caused by certain SNPs that directly modulate the transcription of virulence genes. Here we identified 3,597 transcriptional start sites (TSS) of the ST313 strain D23580, and searched for a gene expression signature linked to pathogenesis of Salmonella. We identified a SNP in the promoter of the pgtE gene that caused high expression of the PgtE virulence factor in African S. Typhimurium, increased the degradation of the factor B component of human complement, contributed to serum resistance and modulated virulence in the chicken infection model. The PgtE protease is known to mediate systemic infection in animal models. We propose that high levels of expression PgtE of by African S. Typhimurium ST313 promotes bacterial survival and bacterial dissemination during human infection. Our finding of a functional role for an extra-genic SNP shows that approaches used to deduce the evolution of virulence in bacterial pathogens should include a focus on non-coding regions of the genome.

Infection of the intestinal tract of the chicken with Campylobacter jejuni is frequently prolonged with limited immune clearance from the caeca, the main site of colonisation. Previously it has been shown early infection of broiler chickens leads to a pro-inflammatory response, followed by regulatory and Th17 responses along with adaptive Th1 and Th2 cytokine responses. Here we show that infection up to 28 days post challenge leads to prolonged expression of IL-4 and high titre IgM and IgY serum antibody responses to C. jeuni, along with increased levels of total IgA in the gut of infected birds. Whilst early pro-inflammatory cytokine and chemokine responses largely wane, expression of both IL-10 and IL-17A remain high in the colonised caeca or caecal tonsils. Based on this and previous studies we hypothesize that the nature of the immune response to C.jeuni infection is one that allows persistence in the gut, but limits inflammation and invasive infection from the gut through maintaining the intestinal barrier and producing secretory antibody. This protects the birds from campylobacteriosis, but the persistence in the gut for the production lifetime of chickens remains an unsolved public health issue.

ABSTRACT Salmonella Enteritidis is the second most common serovar associated with invasive non-typhoidal Salmonella (iNTS) disease in sub-Saharan Africa. Previously, genomic and phylogenetic characterisation of S . Enteritidis isolates from human bloodstream led to the discovery of the Central/Eastern African (CEAC) and West African clades, which were distinct from the gastroenteritis-associated Global Epidemic clade (GEC). The African S . Enteritidis clades have unique genetic signatures that include genomic degradation, novel prophage repertoires and multi-drug resistance, but the molecular basis for the enhanced propensity of African S . Enteritidis to cause bloodstream infection is poorly understood. We used transposon insertion sequencing (TIS) to identify the genetic determinants of the GEC representative strain P125109 and the CEAC representative strain D7795 for growth in three in vitro conditions (LB or minimal NonSPI2 and InSPI2 growth media), and for survival and replication in RAW 264.7 murine macrophages. We identified 207 in vitro -required genes that were common to both S . Enteritidis strains and also required by S . Typhimurium, S . Typhi and Escherichia coli , and 63 genes that were only required by individual S . Enteritidis strains. Similar types of genes were required by both P125109 and D7795 for optimal growth in particular media. Screening the transposon libraries during macrophage infection identified 177 P125109 and 201 D7795 genes that contribute to bacterial survival and replication in mammalian cells. The majority of these genes have proven roles in Salmonella virulence. Our analysis also revealed candidate strain-specific macrophage fitness genes, some of which represent potential novel Salmonella virulence factors. IMPACT STATEMENT Invasive non-typhoidal Salmonella (iNTS) disease is a systemic infection that has a high case fatality rate of 15% and is responsible for an estimated 66,500 deaths/year in sub-Saharan Africa. The main causative agents are pathovariants of Salmonella Typhimurium, known as S . Typhimurium ST313, and Salmonella Enteritidis ( S . Enteritidis), known as Central/Eastern African (CEAC) and West African S . Enteritidis. Whilst the African S . Typhimurium pathovariant has been an active focus of research over the past decade, studies on African S . Enteritidis have been lacking. We used transposon insertion sequencing (TIS) to identify the genetic requirements of both African and Global Epidemic S . Enteritidis to grow in vitro and to infect murine macrophages. To our knowledge, this is the first genome-wide functional analysis of African S . Enteritidis under conditions relevant to infection of a mammalian host. We show that the gene sets required for growth under laboratory conditions and macrophage infection by African and Global Epidemic S . Enteritidis were broadly similar, and that the majority of the genes that contribute to survival and replication in macrophage already have proven roles in Salmonella virulence. Our analysis did identify candidate strain-specific macrophage fitness genes, some of which could be novel Salmonella virulence factors.

BACKGROUND: Campylobacter jejuni, the most frequent cause of foodborne bacterial infection, is found on around 70% of retail chicken. As such there is a need for effective controls in chicken production. Microbial-based controls such as probiotics are attractive to the poultry industry, but of limited efficacy. Furthermore, as commercially-produced chickens have no maternal contact, their pioneer microbiome is likely to come from the hatchery environment. Early delivery of microbials that lead to a more &{prime]natural avian′ microbiome may, therefore, improve bird health and reduce susceptibility to C.jejuni colonisation. A faecal microbiota transplant (FMT) was used to transfer a mature cecal microbiome to newly-hatched broiler chicks and its effects on C.jejuni challenge assessed. We used both a seeder-bird infection model that mimics natural bird-to-bird infection alongside a direct-challenge model. We used a 16S rRNA gene sequencing-based approach to characterize the transplant material itself alongside changes to the chicken microbiome following FMT. RESULTS: FMT changes the composition of the chicken intestinal microbiome. We observed little change in species richness following FMT compared to untreated samples, but there is an increase in phylogenetic diversity within those species. The most significant difference in the ceca is an increase in Lactobacilli, although not a major component of the transplant material, suggesting the FMT results in a change in the intestinal milieu as much as a direct change to the microbiome. Upon direct challenge, FMT resulted in lower initial intestinal colonisation with C.jejuni. More significantly, in a seeder-bird challenge of infection transmission, FMT reduced transmission and intestinal colonisation until common UK retail age of slaughter. In a repeat experiment, transmission was completely blocked following FMT treatment. Delayed FMT administration at 7 days of-age had limited effect on colonisation and transmission. CONCLUSIONS: We show that transfer of a whole mature microbiome to newly-hatched chicks reduces transmission and colonisation of C.jejuni. This indicates that modification of the broiler chick microbiome can reduce intestinal colonisation of C.jejuni to levels projected to lead to lower the human infection rate. We believe these findings offer a way to identify key taxa or consortia that are effective in reducing C.jejuni colonisation and improving broiler gut health.